【摘要】：目的:心力衰竭是許多心血管疾病不可逆轉(zhuǎn)進(jìn)程中的終末階段,而心肌重構(gòu)是心力衰竭的主要的重要的病理變化之一。心室重構(gòu)過程中心肌細(xì)胞肥大及心肌纖維化是其主要的病理形態(tài)改變。如何終止心肌細(xì)胞肥厚以及功能的改變,對于心室重構(gòu)的治療都具有重要的意義。miRNA是一類由miRNA基因編碼的,不編碼蛋白質(zhì)、長度約21個(gè)堿基的RNA單鏈,普遍參與細(xì)胞生理病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),對細(xì)胞功能的維持發(fā)揮重要作用。在心肌肥厚的過程中,miR-26a-5p被發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)差異,這為我們選擇miR-26a-5p提供了理論依據(jù),探討其對心肌細(xì)胞的調(diào)控作用。通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-26a-5p可能是通過調(diào)節(jié)靶基因ULK1發(fā)揮作用,為探索其中的分子調(diào)控機(jī)制提供了思路。關(guān)于miR-26a-5p與ULK1以及自噬活性的變化的研究尚少,所以本研究將miR-26a-5p通過靶向ULK1基因來的調(diào)控自噬活性作為重點(diǎn),進(jìn)一步研究miR-26a-5p對于心肌肥厚的分子調(diào)控機(jī)制,為延緩乃至逆轉(zhuǎn)心臟肥厚提供新的方向。方法:選擇Sprague Dawley大鼠新生1~3天的乳鼠,取出心臟的心室部,用組織塊胰酶消化法消化心室組織,根據(jù)心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異分離純化出心肌細(xì)胞,接種于6孔板中,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)24h,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-26a-5p mimic和inhibitor及其各自的對照轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞中,48h后提取細(xì)胞RNA和總蛋白,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-26a-5p、ULK1m RNA相對表達(dá);用Western blot法檢測ULK1、LC3、自噬相關(guān)蛋白p62的表達(dá)水平;用流式細(xì)胞學(xué)法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá);用透射電鏡檢測細(xì)胞中自噬小泡的形成;結(jié)果:分離得到的原代心肌細(xì)胞,細(xì)胞貼壁后呈圓形或者腎形,具有自主搏動(dòng);一定濃度的Ang Ⅱ可刺激心肌細(xì)胞肥大,肥厚相關(guān)基因表達(dá)增加,同時(shí)誘導(dǎo)ULK1的表達(dá)和自噬活性的增加;ULK1 si RNA干擾ULK1的表達(dá)能夠減輕由Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬活性增加和肥大加劇。miR-26a-5p mimic和inhibitor可以很好地模擬miR-26a-5p過表達(dá)和缺失的情況;隨著miR-26a-5p表達(dá)改變,ULK1基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平也隨之發(fā)生變化;心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic后,LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)減少、自噬相關(guān)蛋白P62表達(dá)增加;反之轉(zhuǎn)染inhibitor的細(xì)胞,LC3 LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)上升、自噬相關(guān)蛋白P62表達(dá)減少,提示在體外Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的中,miR-26a-5p可抑制自噬活性。結(jié)論:在原代心肌細(xì)胞中,miR-26a-5p可以調(diào)控Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,而其調(diào)控的作用機(jī)制是通過抑制自噬通路上ULK1蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞功能,進(jìn)一步調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬活性,進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)心臟肥厚的作用。
【圖文】：

ngII 刺激原代心肌細(xì)胞，對照組不做處理。培養(yǎng)48h后熒光定量PCR法檢測心肌細(xì)胞肥厚相關(guān)基因（ANP 和 度是否發(fā)生改變。GAPDH作為內(nèi)參基因，熔解曲線表明特異性高，無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體影響。結(jié)果表明（ANP 和 β-MHC）的表達(dá)明顯上調(diào)（圖 2），比較有統(tǒng)示了給予10-3mol/l AngII刺激心肌細(xì)胞可引起心肌肥厚相肌細(xì)胞肥大模型。

圖3 AngII刺激心肌細(xì)胞ULK1、miR-26a-5p表達(dá)變化（A）qRT-PCR檢測兩組心肌細(xì)胞ULK1、miR-26a-5p基因的表達(dá)量，＊P<0.05。（B）Western blot檢測ULK1蛋白表達(dá)量，＊P<0.05。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 劉放;高曉健;陸霞;張婷婷;李墨林;;miR-26家族與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2014年11期

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本文編號：2704316