【摘要】：目的:心力衰竭是許多心血管疾病不可逆轉(zhuǎn)進程中的終末階段,而心肌重構(gòu)是心力衰竭的主要的重要的病理變化之一。心室重構(gòu)過程中心肌細胞肥大及心肌纖維化是其主要的病理形態(tài)改變。如何終止心肌細胞肥厚以及功能的改變,對于心室重構(gòu)的治療都具有重要的意義。miRNA是一類由miRNA基因編碼的,不編碼蛋白質(zhì)、長度約21個堿基的RNA單鏈,普遍參與細胞生理病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),對細胞功能的維持發(fā)揮重要作用。在心肌肥厚的過程中,miR-26a-5p被發(fā)現(xiàn)存在表達差異,這為我們選擇miR-26a-5p提供了理論依據(jù),探討其對心肌細胞的調(diào)控作用。通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-26a-5p可能是通過調(diào)節(jié)靶基因ULK1發(fā)揮作用,為探索其中的分子調(diào)控機制提供了思路。關(guān)于miR-26a-5p與ULK1以及自噬活性的變化的研究尚少,所以本研究將miR-26a-5p通過靶向ULK1基因來的調(diào)控自噬活性作為重點,進一步研究miR-26a-5p對于心肌肥厚的分子調(diào)控機制,為延緩乃至逆轉(zhuǎn)心臟肥厚提供新的方向。方法:選擇Sprague Dawley大鼠新生1~3天的乳鼠,取出心臟的心室部,用組織塊胰酶消化法消化心室組織,根據(jù)心肌細胞與心肌成纖維細胞貼壁時間的差異分離純化出心肌細胞,接種于6孔板中,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。細胞培養(yǎng)24h,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-26a-5p mimic和inhibitor及其各自的對照轉(zhuǎn)入心肌細胞中,48h后提取細胞RNA和總蛋白,用實時熒光定量PCR法檢測miR-26a-5p、ULK1m RNA相對表達;用Western blot法檢測ULK1、LC3、自噬相關(guān)蛋白p62的表達水平;用流式細胞學(xué)法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達;用透射電鏡檢測細胞中自噬小泡的形成;結(jié)果:分離得到的原代心肌細胞,細胞貼壁后呈圓形或者腎形,具有自主搏動;一定濃度的Ang Ⅱ可刺激心肌細胞肥大,肥厚相關(guān)基因表達增加,同時誘導(dǎo)ULK1的表達和自噬活性的增加;ULK1 si RNA干擾ULK1的表達能夠減輕由Ang Ⅱ介導(dǎo)的心肌細胞自噬活性增加和肥大加劇。miR-26a-5p mimic和inhibitor可以很好地模擬miR-26a-5p過表達和缺失的情況;隨著miR-26a-5p表達改變,ULK1基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平也隨之發(fā)生變化;心肌細胞轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic后,LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達減少、自噬相關(guān)蛋白P62表達增加;反之轉(zhuǎn)染inhibitor的細胞,LC3 LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達上升、自噬相關(guān)蛋白P62表達減少,提示在體外Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞的中,miR-26a-5p可抑制自噬活性。結(jié)論:在原代心肌細胞中,miR-26a-5p可以調(diào)控Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大,而其調(diào)控的作用機制是通過抑制自噬通路上ULK1蛋白的表達來影響細胞功能,進一步調(diào)節(jié)心肌細胞自噬活性,進而發(fā)揮調(diào)節(jié)心臟肥厚的作用。
【圖文】：

ngII 刺激原代心肌細胞，對照組不做處理。培養(yǎng)48h后熒光定量PCR法檢測心肌細胞肥厚相關(guān)基因（ANP 和 度是否發(fā)生改變。GAPDH作為內(nèi)參基因，熔解曲線表明特異性高，無非特異性擴增和引物二聚體影響。結(jié)果表明（ANP 和 β-MHC）的表達明顯上調(diào)（圖 2），比較有統(tǒng)示了給予10-3mol/l AngII刺激心肌細胞可引起心肌肥厚相肌細胞肥大模型。

圖3 AngII刺激心肌細胞ULK1、miR-26a-5p表達變化（A）qRT-PCR檢測兩組心肌細胞ULK1、miR-26a-5p基因的表達量，＊P<0.05。（B）Western blot檢測ULK1蛋白表達量，＊P<0.05。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊晨晨;盧曉梅;;MTDH、miR-26a與腫瘤關(guān)系的研究進展[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2015年01期

2 劉放;高曉健;陸霞;張婷婷;李墨林;;miR-26家族與腫瘤關(guān)系的研究進展[J];生命科學(xué);2014年11期

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1 杜超翔;MiRNA-26a對大鼠心臟重構(gòu)的調(diào)控作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號：2704316