【摘要】：原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia,ITP)是臨床最為常見的自身免疫性出血性疾病。ITP的主要發(fā)病機(jī)制:1.患者對(duì)自身抗原的免疫失耐受:2.體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板破壞過多;3.巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常導(dǎo)致血小板產(chǎn)生不足。4.CD4+CD25+Foxp3+自然調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(natural regulatory T cell,nTreg)可抑制 T細(xì)胞增殖與擴(kuò)增,為維持免疫耐受狀態(tài)所必需,其數(shù)量及功能下降在ITP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。近年來大量研究發(fā)現(xiàn),組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)具有免疫調(diào)節(jié)活性,低劑量HDACi可以抑制幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者1和炎癥性腸病、結(jié)腸炎動(dòng)物模型炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子活性;低劑量組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)亦可以上調(diào)Foxp3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量與功能,減輕移植物抗宿主病(GVHD)反應(yīng)2。然而目前,尚無研究證實(shí)組蛋白去乙�；敢种苿┰贗TP中是否具有上述作用。本研究以ITP主動(dòng)模型鼠為研究對(duì)象,給予低劑量組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)西達(dá)本胺治療,采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)ITP動(dòng)物模型小鼠脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)細(xì)胞比例。研究發(fā)現(xiàn),低劑量HDACi治療可顯著升高ITP動(dòng)物模型外周血血小板水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),低劑量HDACi治療后ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及比例取得了明顯升高。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)又稱CD152,表達(dá)于活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞胞內(nèi)及胞膜膜表面,CTLA4與CD28分子高度同源,二者均可以與B7分子結(jié)合,CTLA4與B7分子結(jié)合后將降低T細(xì)胞應(yīng)答,阻斷T細(xì)胞活化的共刺激通路,對(duì)T細(xì)胞活化產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了 HDACi西達(dá)本胺治療后ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞膜表面CTLA4表達(dá)。采用QT-PCR技術(shù)檢測(cè)ITP動(dòng)物模型小鼠脾細(xì)胞CTLA4基因mRNA表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),HDACi西達(dá)本胺治療顯著提高了 ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞膜表面CTLA4表達(dá)。QT-PCR結(jié)果顯示,低劑量HDACi西達(dá)本胺治療后主動(dòng)ITP模型小鼠脾細(xì)胞CTLA4基因mRNA表達(dá)水平顯著上升。隨后本研究以ITP患者及健康對(duì)照組為研究對(duì)象,分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),體外培養(yǎng),給予低劑量西達(dá)本胺干預(yù),檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例,檢測(cè)低劑量西達(dá)本胺對(duì)外周血PBMC培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響。然后,本研究采用免疫磁珠方法分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞及CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞,給予低劑量西達(dá)本胺治療,檢測(cè)低劑量西達(dá)本胺治療后,CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用。另外,本研究進(jìn)一步探討了 ITP患者單核細(xì)胞培養(yǎng)體系西達(dá)本胺治療前后CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞CTLA4表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),低劑量西達(dá)本胺可顯著提高ITP患者外周血PBMC培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及數(shù)量。低劑量西達(dá)本胺可顯著促進(jìn)ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞CTLA4的表達(dá)。低劑量西達(dá)本胺可顯著提高ITP患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用,即提高了 CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫抑制作用。最后,本研究采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)檢測(cè)ITP患者與正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；�,發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC組蛋白H3K27乙酰化水平較正常對(duì)照顯著降低。將ITP患者單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離,體外培養(yǎng),給予低劑量西達(dá)本胺治療,發(fā)現(xiàn)低劑量西達(dá)本胺可顯著提高ITP患者PBMCs組蛋白H3K27乙�；健＞C上所述,低劑量西達(dá)本胺可促進(jìn)ITP動(dòng)物模型CD4+CD25+Foxp3+nTreg細(xì)胞生成,提高ITP動(dòng)物模型外周血血小板水平;促使ITP患者外周血T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)ITP患者Treg細(xì)胞免疫抑制功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；捷^正常對(duì)照顯著降低,該異常可能導(dǎo)致了 CTLA4基因表達(dá)水平下降,患者免疫耐受性下降,參與ITP的發(fā)病過程。低劑量西達(dá)本胺可上調(diào)ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CTLA4基因乙�；M蛋白H3K27水平,誘導(dǎo)免疫耐受。因此低劑量西達(dá)本胺可應(yīng)用于ITP的臨床治療,有望改善ITP患者的預(yù)后。第一部分低劑量西達(dá)本胺對(duì)ITP主動(dòng)模型的治療作用及對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞生成、CTLA4基因表達(dá)的影響研究目的:研究低劑量HDACi對(duì)ITP動(dòng)物模型是否具有治療作用。檢測(cè)HDACi治療后ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+nTreg細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞比例,以及CD4+T細(xì)胞膜表面CTLA4表達(dá),以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HDACi對(duì)ITP的具體作用機(jī)制。研究方法:1.構(gòu)建ITP主動(dòng)模型小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組與西達(dá)本胺治療組,對(duì)照組給予磷酸緩沖鹽溶液(PBS)灌胃,治療組給予低劑量西達(dá)本胺(0.1mg/kg)灌胃。每周檢測(cè)1次小鼠外周血血常規(guī)。2.建模4周后處死小鼠,制備小鼠脾細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞檢測(cè)方法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg細(xì)胞)比例,檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中CTLA4表達(dá)情況。采用QT-PCR方法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞CTLA4 mRNA表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.低劑量西達(dá)本胺顯著提高了 ITP動(dòng)物模型外周血血小板水平,降低出血相關(guān)死亡率,改善ITP動(dòng)物模型的總生存。2.低劑量西達(dá)本胺顯著提高了 ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及比例。3.低劑量西達(dá)本胺顯著提高了 ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞中CTLA4表達(dá)。4.低劑量西達(dá)本胺顯著上調(diào)了 ITP動(dòng)物模型脾細(xì)胞CTLA4基因表達(dá)。研究結(jié)論:低劑量西達(dá)本胺對(duì)主動(dòng)模型ITP小鼠具有顯著的治療作用,可上調(diào)nTreg數(shù)量與比例,上調(diào)CTLA4表達(dá),從而促進(jìn)免疫耐受。第二部分:低劑量西達(dá)本胺對(duì)ITP患者Treg細(xì)胞生成、CTLA4表達(dá)、及對(duì)Treg細(xì)胞免疫抑制功能的作用研究研究目的:研究HDACi對(duì)ITP患者外周血PBMC培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞生成及CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制功能的影響。研究低劑量西達(dá)本胺對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞表達(dá) CTLA4 的影響。研究方法:1.采集ITP患者及健康對(duì)照組的外周血,并分離PBMC細(xì)胞。2.以植物血凝素、IL-2刺激淋巴細(xì)胞體外生長,建立PBMC細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。3.將ITP患者與健康對(duì)照組PBMC細(xì)胞與低劑量西達(dá)本胺共培養(yǎng),收集細(xì)胞用于流式檢測(cè)。4.以PEcy5-CD4、FITC-CD25、APC-Foxp3單克隆抗體標(biāo)記Treg細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞比例。5.以 PEcy5-CD4、FITC-CD25、APC-Foxp3 單克隆抗體標(biāo)記 Treg 細(xì)胞,以PE-CTLA4單克隆抗體標(biāo)記CTLA4,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+TregTM細(xì)胞CTLA4表達(dá)情況。6.以免疫磁珠方法分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞及CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞,給予低劑量西達(dá)本胺治療,檢測(cè)CD4+CD25+ Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用。研究結(jié)果:1.低劑量西達(dá)本胺可顯著提高ITP患者外周血PBMC培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及數(shù)量。2.低劑量西達(dá)本胺可顯著促進(jìn)ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞CTLA4的表達(dá)。3.低劑量西達(dá)本胺可顯著增強(qiáng)CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖的抑制作用,即提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫抑制作用。研究結(jié)論:低劑量西達(dá)本胺可顯著提高ITP患者外周血PBMC培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及數(shù)量;促進(jìn)ITP患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞CTLA4的表達(dá);提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫抑制作用,從而促進(jìn)免疫耐受。第三部分:低劑量西達(dá)本胺調(diào)節(jié)CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；秸T導(dǎo)ITP患者免疫耐受研究目的:研究ITP患者及健康對(duì)照組外周血PBMC中CTLA4基因組蛋白H3K27乙酰化水平。然后,將ITP患者外周血PBMC分離并體外培養(yǎng),給予低劑量西達(dá)本胺治療,檢測(cè)HDACi對(duì)ITP患者外周血PBMC培養(yǎng)體系中CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；降挠绊憽Ｑ芯糠椒�:1.采集ITP患者及正常對(duì)照組的外周血,并分離PBMC細(xì)胞。2.采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法檢測(cè)ITP患者及健康對(duì)照組PBMC細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；�。3.將ITP患者PBMC體外培養(yǎng),給予低劑量西達(dá)本胺干預(yù),采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法檢測(cè)西達(dá)本胺治療前后PBMC細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙酰化水平。研究結(jié)果:1.ITP患者PBMC細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；捷^健康對(duì)照顯著降低。2.西達(dá)本胺治療可顯著提高ITP患者外周血PBMC細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙酰化水平,提高ITP患者外周血PBMC細(xì)胞CTLA4表達(dá),促進(jìn)免疫耐受。研究結(jié)論:1.ITP患者PBMC細(xì)胞組蛋白H3K27乙�；捷^健康對(duì)照顯著降低。該異�？赡軐�(dǎo)致了 CTLA4基因表達(dá)水平下降,患者免疫耐受性下降,參與ITP的發(fā)病過程。2.西達(dá)本胺可上調(diào)ITP患者單個(gè)核細(xì)胞CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；�,糾正ITP患者CTLA4基因組蛋白H3K27乙�；惓�,誘導(dǎo)免疫耐受。3.西達(dá)本胺可以應(yīng)用于ITP的臨床治療,有望改善ITP患者的預(yù)后。
【圖文】：

圖１：低劑量西達(dá)本胺治療明顯提高了主動(dòng)ＩＴＰ模型鼠外周血血小板水平。主動(dòng)模型小鼠在建模同時(shí)給予低劑量西達(dá)本胺治療。建模第７天，主動(dòng)ＩＴＰ模型小鼠治血小板水平明顯高于對(duì)照組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（３１９．２邋±邋４７．４邋ｘ邋１０９／Ｌ邋ｖ＾．邋２６６．５Ｍ０９／Ｌ，治療組ｎ＝１２，對(duì)照組ｎ＝１０，尸＞０．０５）。建模第１４天，兩組血小板水至最低，，兩組比較治療組血小板水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（］６６．４±邋ｘ邋ｌ0９／Ｌ邋ｗ．邋７６．２５邋±邋３０．８８邋ｘ邋１0９／ｌ，治療組邋ｎ邋＝邋１１，對(duì)照組邋ｎ邋＝邋８，尸邋＜邋０．０５）；第邋２１邋天，組血小板水平均有輕度上升，治療組血小板仍顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（３１９．１邋±６１．７１邋ｘ邋ｉ0９／ｌＶｉＳ．邋１４７．】邋±５６．６４邋ｘ邋１0９幾，治療組邋ｎ＝邋１１，對(duì)照組邋ｎ邋＝邋７，尸邋＜０．０

圖２：低劑量西達(dá)本胺治療明顯增加了主動(dòng)ＩＴＰ模型小鼠脾細(xì)胞中ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調(diào)節(jié)Ｔ逡逑細(xì)胞水平及ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調(diào)節(jié)Ｔ細(xì)胞水平。低劑量西達(dá)本胺治療４周，主動(dòng)丨ＴＰ逡逑模型鼠ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細(xì)胞比例及數(shù)量均有顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（治療組；逡逑８＿２５５邋±２．４２１％低對(duì)照組邋３．５８２±０＿５０８％，治療組１１＝１１，對(duì)照組１１邋＝邋５，／＞＜０．０５，？４逡逑２Ａ）。與ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細(xì)胞相一致，低劑量西達(dá)本胺治療４周，主動(dòng)ＩＴＰ模型鼠逡逑ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細(xì)胞比例及數(shù)量均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（治療組３．３４６逡逑±０．３９８％ｕｓ．邋１．９８９邋±０．３０１％，治療組邋ｎ＝邋１１，對(duì)照組邋ｎ邋＝邋５，尸＜邋０．０５，邋Ｆｉｇ邋２Ｂ邋ａｎｄ邋２Ｃ）逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R558.2

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