【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,脂質(zhì)浸潤(rùn)、慢性炎癥、血流剪切應(yīng)力、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein,ox LDL)等諸多因素參與其中,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成是As發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)和巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的主要來(lái)源,新近研究發(fā)現(xiàn),人體As斑塊中超過(guò)50%的泡沫細(xì)胞源于VSMCs,說(shuō)明VSMCs在As發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占據(jù)重要地位,抑制VSMCs脂質(zhì)蓄積以及VSMCs源性泡沫細(xì)胞形成對(duì)As防治具有非常積極的意義。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter,ABCA1)是一種細(xì)胞膜結(jié)合蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇流出(Free cholesterol,FC)至乏脂的載脂蛋白A-1(apolipoprotein,apo A-1)上,進(jìn)一步形成高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),這一過(guò)程是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)的起始步驟,也是維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的關(guān)鍵,對(duì)抑制血管內(nèi)泡沫細(xì)胞形成,緩解As進(jìn)展具有重要作用。臨床研究顯示,冠心病患者As病變程度與VSMCs內(nèi)ABCA1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān);動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,ABCA1表達(dá)減少是引起VSMCs內(nèi)膽固醇蓄積的主要原因,以上提示上調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1表達(dá)可能是防止細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)渡蓄積,抑制VSMCs源性泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。心肌素(Myocardin,MYOCD)是一種核蛋白,也是目前已知強(qiáng)有力的VSMCs特異性基因轉(zhuǎn)錄共激活因子之一。有研究指出MYOCD與As性心腦血管疾病密切相關(guān),MYOCD在冠心病患者冠狀動(dòng)脈中表達(dá)明顯下降;過(guò)表達(dá)MYOCD能抑制血管炎癥和VSMCs異常增殖、遷移;MYOCD還可以促進(jìn)VSMCs的小凹蛋白-1形成,而小凹蛋白-1是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇向胞膜移行的關(guān)鍵蛋白,提示MYOCD參與VSMCs膽固醇代謝的調(diào)控。因此,本研究著重探討MYOCD能否上調(diào)ABCA1表達(dá)并調(diào)控VSMCs膽固醇流出這一科學(xué)問(wèn)題。血清應(yīng)答因子(serum response factor,SRF)是在VSMCs、心肌細(xì)胞等細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,它能夠特異性結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的CAr G-box序列,從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究顯示,MYOCD以“三明治”形式與SRF結(jié)合,即兩個(gè)MYOCD分子與一個(gè)SRF分子形成復(fù)合物,共同絡(luò)合靶基因序列的CAr G-box,從而增加SRF與CAr G-box結(jié)合的穩(wěn)定性,加強(qiáng)了SRF轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)靶基因的表達(dá)。以上表明MYOCD發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能與SRF密不可分。因此,我們推測(cè)SRF可能參與MYOCD對(duì)VSMCs內(nèi)ABCA1基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。Micro RNA(mi RNAs)是長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,通過(guò)與靶基因m RNA的3’-UTR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),mi R-27a/b、mi R-467b、mi R-186等多種mi RNAs參與As發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Mi R-1192于2013年被發(fā)現(xiàn),基因組學(xué)分析表明mi R-1192(Gene ID:100316672)位于19號(hào)染色體19b;19 17.91 c M位點(diǎn)。研究顯示,mi R-1192抑制損傷后的細(xì)胞修復(fù),參與細(xì)胞分化的調(diào)節(jié),并且mi R-1192還可促進(jìn)炎癥反應(yīng),提示mi R-1192可能具有促As的生物學(xué)效應(yīng)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析顯示,MYOCD 3’-UTR存在mi R-1192結(jié)合位點(diǎn),而SRF、ABCA1的3’-UTR無(wú)mi R-1192的結(jié)合位點(diǎn)。說(shuō)明,mi R-1192具有靶向抑制MYOCD的生物學(xué)基礎(chǔ),并且對(duì)MYOCD下游基因表達(dá)無(wú)干擾。因此,本研究關(guān)注的第二個(gè)科學(xué)問(wèn)題是MYOCD的上游的調(diào)控機(jī)制,探討mi R-1192是否對(duì)MYOCD具有靶向抑制作用,為開(kāi)展以MYOCD為靶點(diǎn)的As防治策略提供思路。綜上,我們提出這一工作假說(shuō):“MYOCD通過(guò)SRF上調(diào)ABCA1表達(dá),促進(jìn)膽固醇流出,抑制泡沫細(xì)胞形成和As發(fā)生發(fā)展;mi R-1192靶向抑制MYOCD,下調(diào)ABCA1表達(dá),抑制膽固醇流出,發(fā)揮促As作用”。為驗(yàn)證假說(shuō),我們?cè)O(shè)計(jì)了4部分實(shí)驗(yàn)。首先,我們觀察MYOCD對(duì)ABCA1表達(dá)和VSMCs膽固醇流出的影響。接著,我們探討MYOCD上調(diào)ABCA1的具體機(jī)制,研究MYOCD能否與SRF結(jié)合,SRF是否具備結(jié)合ABCA1基因啟動(dòng)子能力。第三,我們觀察MYOCD是否上調(diào)小鼠動(dòng)脈ABCA1表達(dá),并影響apo E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。最后,我們研究MYOCD的上游調(diào)控機(jī)制,探討mi R-1192能否靶向結(jié)合MYOCD m RNA的3’-UTR并抑制其表達(dá),進(jìn)而減少ABCA1介導(dǎo)的VSMCs膽固醇流出。本研究有望為As防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。第一部分MYOCD上調(diào)ABCA1抑制VSMCs膽固醇蓄積目的:觀察MYOCD對(duì)ABCA1表達(dá)和VSMCs膽固醇流出的影響,探討MYOCD是否通過(guò)上調(diào)ABCA1表達(dá)促進(jìn)VSMCs膽固醇流出,抑制VSMCs膽固醇蓄積。方法:培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells,T/G HA-VSMCs),用50μg/ml ox-LDL處理HA-VSMCs 96小時(shí),使其荷脂,構(gòu)建得到VSMCs源性泡沫細(xì)胞模型。用100n M的MYOCD過(guò)表達(dá)或沉默載體處理荷脂的VSMCs 24小時(shí),觀察MYOCD對(duì)VSMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化的作用。采用液體閃爍技術(shù)檢測(cè)VSMCs內(nèi)膽固醇流出水平,高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)VSMCs內(nèi)總膽固醇(total cholesterol,TC)、游離膽固醇(free cholesterol FC)和膽固醇酯(cholesterol ester,CE)的含量。構(gòu)建過(guò)表達(dá)或沉默MYOCD載體載體,轉(zhuǎn)染VSMCs,采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative PCR,q RT-PCR)和Western blot方法分別檢測(cè)ABCA1 m RNA和蛋白水平,觀察MYOCD對(duì)VSMCs的ABCA1表達(dá)的影響。MYOCD與sh ABCA1共轉(zhuǎn)染VSMCs,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出水平,探討MYOCD是否以ABCA1依賴的方式介導(dǎo)的膽固醇流出。結(jié)果:液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)顯示,MYOCD過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染促進(jìn)VSMCs源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出。HPLC檢測(cè)顯示MYOCD過(guò)表達(dá)能明顯減少VSMCs源性泡沫細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE含量。q RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)MYOCD可顯著上調(diào)ABCA1 m RNA和蛋白表達(dá)水平,沉默MYOCD則顯著下調(diào)ABCA1 m RNA和蛋白表達(dá)水平。干擾ABCA1能夠消除MYOCD對(duì)VSMCs膽固醇流出的促進(jìn)作用,提示MYOCD以ABCA1依賴的方式促進(jìn)VSMCs膽固醇流出。小結(jié):MYOCD上調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1 m RNA和蛋白水平,促進(jìn)VSMCs膽固醇流出,降低VSMCs內(nèi)TC、FC和CE水平。第二部分MYOCD結(jié)合SRF促進(jìn)VSMCs的ABCA1表達(dá)目的:探討MYOCD是否通過(guò)結(jié)合SRF上調(diào)ABCA1表達(dá),促進(jìn)ABCA1介導(dǎo)的VSMCs膽固醇流出。方法:利用Promo Home Page等生物信息學(xué)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析ABCA1啟動(dòng)子序列是否存在SRF的結(jié)合位點(diǎn)。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP實(shí)驗(yàn))檢測(cè)SRF與ABCA1啟動(dòng)子結(jié)合能力,判斷結(jié)合位點(diǎn)。免疫共沉淀檢測(cè)MYOCD與SRF的結(jié)合情況。將MYOCD、SRF與野生型或突變型ABCA1啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞,采用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)啟動(dòng)子活性。采用沉默或過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染sh SRF、MYOCD、MYOCD+SRF和MYOCD+sh SRF,q RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)ABCA1 m RNA和蛋白水平,利用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)VSMCs的膽固醇流出水平。結(jié)果:生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ABCA1啟動(dòng)子區(qū)序列存在SRF結(jié)合位點(diǎn)CAr G-box,人ABCA1啟動(dòng)子序列存在兩處可能結(jié)合位點(diǎn)Site1和Site2。Ch IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)SRF能夠絡(luò)合ABCA1序列。免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MYOCD能與SRF結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MYOCD不與ABCA1啟動(dòng)子直接結(jié)合,SRF與ABCA1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,但MYOCD與SRF共結(jié)合明顯增加ABCA1啟動(dòng)子活性。分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)MYOCD和沉默SRF載體,q RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,MYOCD與SRF結(jié)合后能顯著上調(diào)ABCA1 m RNA和蛋白水平。液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MYOCD與SRF結(jié)合后能明顯促進(jìn)VSMCs內(nèi)膽固醇流出。小結(jié):MYOCD通過(guò)SRF上調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1 m RNA和蛋白水平,促進(jìn)VSMCs膽固醇流出。第三部分MYOCD抑制apo E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成目的:觀察MYOCD對(duì)apo E-/-小鼠主動(dòng)脈ABCA1表達(dá)的影響,對(duì)小鼠血脂水平、主動(dòng)脈竇As斑塊面積的影響。方法:以6周齡雄性po E基因敲除(apo E-/-)小鼠為研究對(duì)象,隨機(jī)分為對(duì)照組、MYOCD組和sh MYOCD組,分別轉(zhuǎn)染病毒載體,r Ad-MYOCD、r Ad-sh MYOCD以及r Ad-,過(guò)表達(dá)或抑制apo E-/-主動(dòng)脈MYOCD表達(dá)。用高脂/高膽固醇飲食喂12周后處死,利用眼球后取血法收集各組小鼠血液,分離血清,通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)水平。獲取小鼠的主動(dòng)脈標(biāo)本,采用q RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)各組標(biāo)本ABCA1 m RNA和蛋白表達(dá)以及炎癥因子表情況。獲取小鼠心臟標(biāo)本行冰凍切片,免疫熒光和免疫組化染色檢測(cè)主動(dòng)脈瓣斑塊處MYOCD表達(dá)情況。分離各組apo E-/-小鼠主動(dòng)脈弓,體視顯微鏡下觀察主動(dòng)脈弓及其三大分支(左鎖骨下動(dòng)脈、左頸總動(dòng)脈、頭臂干動(dòng)脈)As斑塊面積。利用油紅O染色法觀察apo E-/-小鼠主動(dòng)脈血管壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。HE以及Masson染色法觀察apo E-/-小鼠主動(dòng)脈竇As斑塊面積、脂質(zhì)蓄積和膠原含量的情況。結(jié)果:化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)證實(shí)過(guò)表達(dá)人MYOCD和沉默人MYOCD不影響apo E-/-小鼠ALT、ALP和AST水平,提示MYOCD不影響肝臟代謝脂質(zhì)的功能。q RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MYOCD能明顯促進(jìn)ABCA1 m RNA和蛋白表達(dá),炎癥因子表達(dá)減少。過(guò)表達(dá)MYOCD能顯著減少主動(dòng)脈弓及主動(dòng)脈竇內(nèi)As斑塊面積,降低主動(dòng)脈血管壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積含量,并增加As斑塊內(nèi)的膠原含量。而沉默MYOCD則明顯增加主動(dòng)脈弓及主動(dòng)脈竇內(nèi)As斑塊面積,促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)蓄積,減少As斑塊內(nèi)膠原含量。小結(jié):MYOCD上調(diào)apo E-/-小鼠主動(dòng)脈ABCA1 m RNA和蛋白水平,減少apo E-/-小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積。第四部分Mi R-1192靶向抑制MYOCD減少VSMCs膽固醇流出目的:探討mi R-1192是否通過(guò)靶向結(jié)合MYOCD m RNA 3’-UTR抑制其表達(dá),減少ABCA1介導(dǎo)的VSMCs膽固醇流出。方法:利用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)mi R-1192與MYOCD m RNA的靶向結(jié)合能力,并預(yù)測(cè)其結(jié)合自由能情況。將mi R-1192 mimic與野生型和突變型MYOCD 3’-UTR報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞,采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)mi R-1192與MYOCD 3’-UTR靶向結(jié)合能力。并構(gòu)建p GL3-ABCA1-3’-UTR、p GL3-SRF-3’-UTR重組質(zhì)粒,再分別與mi R-1192 mimic共轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞,采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)mi R-1192與ABCA1或SRF結(jié)合情況。將mi R-1192 mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈VSMCs,q RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)MYOCD m RNA及蛋白水平。以HA-VSMCs為觀測(cè)對(duì)象,分別轉(zhuǎn)染MYOCD、mi R-1192 mimic、mi R-1192 mimic+MYOCD,利用q RT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)ABCA1的m RNA及其蛋白水平,利用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)VSMCs內(nèi)膽固醇流出的水平。結(jié)果:多個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)mi R-1192具有靶向結(jié)合MYOCD的生物學(xué)基礎(chǔ)。采用熒光素酶基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-1192 mimic與野生型MYOCD 3’-UTR共轉(zhuǎn)染后其熒光素酶活性與mimic-neg對(duì)照組相比明顯降低,而MYOCD突變組的熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。mi R-1192 mimic分別與ABCA1或SRF共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞后,兩組的均不能改變熒光素酶活性。q RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),mi R-1192mimic能顯著降低MYOCD m RNA和蛋白表達(dá)水平。與MYOCD組相比,mi R-1192 mimic能通抑制ABCA1 m RNA和蛋白表達(dá)。液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mi R-1192 mimic能明顯抑制VSMCS內(nèi)膽固醇流出。小結(jié):Mi R-1192靶向抑制MYOCD表達(dá),下調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1m RNA和蛋白水平,減少ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出。結(jié)論1、MYOCD上調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1 m RNA和蛋白水平,促進(jìn)VSMCs膽固醇流出,降低VSMCs內(nèi)TC、FC和CE水平。2、MYOCD通過(guò)SRF上調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1 m RNA和蛋白水平,促進(jìn)VSMCs膽固醇流出。3、MYOCD上調(diào)apo E-/-小鼠主動(dòng)脈ABCA1 m RNA和蛋白水平,減少apo E-/-小鼠主動(dòng)脈As斑塊面積。4、Mi R-1192靶向抑制MYOCD表達(dá),下調(diào)VSMCs內(nèi)ABCA1 m RNA和蛋白水平,減少ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出。
【圖文】：

圖 1-1 科學(xué)假說(shuō)模式圖miR-1192 靶向沉默 MYOCD，，抑制 SRF 與 ABCA1 啟動(dòng)子序列 CArG-box 結(jié)合，BCA1 表達(dá)及其介導(dǎo)的膽固醇流出，促進(jìn) As 發(fā)生發(fā)展。MYOCD：心肌素，SRF：答因子，apoA-1：載脂蛋白 A-1，ABCA1：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1，As：

圖 2-1 過(guò)表達(dá)或沉默 MYOCD 對(duì) VSMCs 內(nèi) MYOCD 表達(dá)的影響(n=3)注：*P＜0.05, vs. control.2.4.2 MYOCD 對(duì) VSMCs 膽固醇流出的影響為了探討 MYOCD 對(duì) VSMCs 內(nèi)的膽固醇流出的作用，首先用 50μg/m
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾慶壇;郝長(zhǎng)寧;闞科佳;吳圣俊;齊昊U

本文編號(hào)：2696718