【摘要】：研究背景糖尿病下肢血管病變(lower extremity arterial disease,LEAD)是糖尿病常見的并發(fā)癥,據(jù)統(tǒng)計,LEAD是糖尿病患者住院的常見原因,可導(dǎo)致患者足潰瘍、壞疽甚至截肢,使患者失去正�；顒幽芰�,醫(yī)療費用每年超過10億美元[1]。在全球,超過半數(shù)的下肢截肢與糖尿病有關(guān)。經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)是一種經(jīng)典的微創(chuàng)治療方法,適用于對內(nèi)科保守治療無效且不能耐受手術(shù)的患者,血管內(nèi)支架成形術(shù)和經(jīng)皮球囊擴張血管成形術(shù)是兩種主流的介入術(shù)式。球囊擴張術(shù)是利用擴張球囊產(chǎn)生一定的壓力擠壓斑塊,使斑塊斷裂回縮,從而再通被斑塊阻塞的血管管腔;而支架成形術(shù)則通過向斑塊形成的血管內(nèi)放入支架以擠壓斑塊來擴張被阻塞的血管[2]。對于提高乆以下動脈的長期通暢率的療效,支架成形術(shù)仍存在爭議,并且糖尿病LEAD的病變范圍主要在乆動脈的下行部位——脛、腓動脈和分支動脈,該部位由于血管較細、運動強度比較大,不適合應(yīng)用支架,因此,經(jīng)皮球囊擴張血管成形術(shù)就成為了LEAD的主要治療方式,目前,狹義PTA是指經(jīng)皮球囊擴張血管成形術(shù)。然而,據(jù)不完全統(tǒng)計,PTA術(shù)后1年再狹窄(Restenosis,RS)率約為50%-70%[31,嚴重降低了PTA的遠期療效,影響患者的預(yù)后。因此,闡明PTA術(shù)后RS的發(fā)病機制,防止RS的發(fā)生,是當前治療外周血管疾病所關(guān)注的熱點問題,是推進糖尿病LEAD治療進程的關(guān)鍵。研究目的構(gòu)建再狹窄動物模型,明確Lin28a在糖尿病下肢血管病變球擴后再狹窄斑塊中的高表達情況,并進一步通過細胞實驗研究其作用機制。研究方法第一部分:選取1月大的90-100g SD大鼠,用正常飼料喂養(yǎng)一個星期,再給予高脂飼料喂養(yǎng),體重達300g時行腹腔葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)、胰島素敏感性試驗(intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)檢測,篩選出胰島素抵抗的大鼠,予以腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)27.5mg/kg的方式構(gòu)建2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠模型,連續(xù)兩次測得空腹血糖≥ 11.1mmol/l,并且具有“三多”癥狀(多尿、多飲、多食)的大鼠則認為T2DM造模成功。成模后隨機分為以下2組:動脈粥樣硬化組(AS組)和再狹窄組(RS組)。AS組予以球囊拉傷術(shù)構(gòu)建動脈粥樣硬化斑塊模型,RS組予以球囊拉傷聯(lián)合球囊擴張術(shù)構(gòu)建再狹窄斑塊模型。兩組分別在術(shù)前、術(shù)后4周行多普勒超聲檢查斑塊形成情況。實驗結(jié)束后,過量麻藥處死動物,用蘇木素-伊紅(HE)染色血管組織以確定兩組模型的成功構(gòu)建。免疫組化檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Lin28a在兩種斑塊內(nèi)的差異性表達情況,免疫熒光雙染檢測α-SMA和Lin28a組織內(nèi)共表達情況,qRT-PCR檢測兩組斑塊內(nèi)Lin28a表達變化情況。第二部分:大鼠主動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)提取、培養(yǎng)和鑒定后,慢病毒干預(yù)平滑肌細胞內(nèi)Lin28a的表達,分為以下3組:A:Lin28a過表達慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs(Lin28a+),B:攜帶GFP空載質(zhì)慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs(control),C:Lin28a干擾病毒轉(zhuǎn)染VSMCs(Lin28a-)。采用免疫印記法(Western blot)和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測3組Lin28a的表達,明確Lin28a干預(yù)的效果。采用EdU法、Transwell小室來分別檢測VSMCs的增殖能力和遷移能力。統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)應(yīng)用均值±標準差(mean±SE)來表示,使用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析,采用非配對t檢驗的方法來進行兩組之間差異性的分析。如果P0.05,則兩組間的差異被認為是有統(tǒng)計學意義的(雙側(cè))。研究結(jié)果第一部分:1、動物一般情況:40只大鼠高脂飼至體重達300g后,經(jīng)IPGTT、IPITT檢測均產(chǎn)生胰島素抵抗。腹腔注射STZ后,共30只大鼠成功達到了 T2DM的造模標準,并排除了血糖未達標的大鼠。實驗結(jié)束后,AS組剩余8只,RS組剩余7只。兩組大鼠基線數(shù)據(jù)(體重、血糖水平)在統(tǒng)計學上沒有差異(P0.05)(見表1)。2、超聲檢測結(jié)果:于球囊拉傷前行超聲檢查,可見血管通暢(圖1A),球囊拉傷術(shù)后4周對大鼠進行超聲檢查,兩組可見低回聲斑塊(圖1B);RS組PTA術(shù)后1周,超聲檢測髂內(nèi)動脈狹窄部位血流恢復(fù)(圖1C)。PTA術(shù)后4周,RS組再次超聲檢測髂內(nèi)動脈,可見管腔再次狹窄,血流信號減弱,有低回聲斑塊形成(圖1D),提示形成再狹窄斑塊。3、斑塊組成成分及Lin28a表達情況結(jié)果:AS組的HE染色顯示大鼠血管狹窄和粥樣硬化斑塊形成(圖2A)。RS組觀察到大鼠血管的管腔狹窄,大量新生的細胞呈無序排列(圖2B)。α-SMA和Lin28a免疫組化染色結(jié)果顯示:AS組血管斑塊中的VSMCs較少見,而RS組斑塊中則充滿VSMCs(圖3);AS組Lin28a陽染細胞較少,但在RS組的陽染數(shù)顯著高于AS組(圖4)(P0.05)。α-SMA和Lin28a免疫熒光雙染結(jié)果顯示:Lin28a陽染的細胞α-SMA染色也是陽性(圖5)。4、qRT-PCR結(jié)果顯示:相比于AS組,RS組內(nèi)Lin28a在mRNA水平升高明顯(圖6)(P0.05)。第二部分:1、大鼠原代主動脈血管平滑肌細胞的提取、培養(yǎng)和鑒定:采用組織貼塊法成功提取大鼠原代主動脈血管平滑肌細胞,免疫熒光顯示提取的細胞表達α-SMA和SM-22。2、慢病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)檢測結(jié)果:選取MO1=20為感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染細胞。3、Western blotting、、qRT-PCR:各組Lin28a蛋白和mRNA含量結(jié)果顯示:與空載病毒組相比,干擾組Lin28a在蛋白水平和mRNA水平均表達下降(P0.05),過表達組Lin28a表達上調(diào)(P0.05)(圖 10)。4、EdU法檢測細胞增殖能力:與空載病毒組相比,Lin28a干擾組細胞增殖數(shù)減少(P0.05);Lin28a過表達組細胞增殖數(shù)量增加(P0.05)(圖11)。5、細胞遷移實驗:抑制Lin28a表達,細胞遷移數(shù)量明顯低于對照組(P0.05);過表達組中細胞遷移的數(shù)量增加(P0.05)(圖12)。研究結(jié)論1、體內(nèi)實驗表明,在RS斑塊中,構(gòu)成斑塊的主要成分是平滑肌細胞,同時,在斑塊內(nèi)Lin28a在蛋白和mRNA水平表達均升高。2、體外實驗表明,過表達平滑肌細胞的Lin28a,可促進細胞遷移與增殖,而抑制細胞內(nèi)Lin28a的表達后則可以抑制平滑肌細胞遷移與增殖,對RS的形成具有預(yù)防作用。
【圖文】：

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圖１．不同時間點超聲圖。逡逑Ａ：正常血管超聲圖；Ｂ：球囊拉傷術(shù)后４周血管超聲圖；逡逑Ｃ：邋ＰＴＡ手術(shù)后血管再通超聲圖；Ｄ：再狹窄斑塊形成超聲圖。逡逑■ＳＪ．…、Ｃ邋？邋＇邋ｊ逡逑，，雋？：、、’，？？邋Ｗ＇、，？ｖ？邐＼逡逑勹邋Ｔ邋？？＊＊＇＇？邋，，＊＾邋？、’＼邋ｖ邋＊邋？＾一邋？；邋－邋—？、々－．．、逡逑，邐？邐＊邐．邋＿邐＊＊邐Ｉ邐？邐＇＾＊邐－？ｌ邐Ｉ邐１邐．邐？逡逑Ｉ邋Ｉ邋＇邋－邐ｔ邋Ｕ邐＜？？？、：．＊邐＊邐＇邋ｆ邐／邋Ａ邋．？＊＇邋＜ｒ邐？－＊，，，，■＊邐，逡逑：逡逑＊邋＊邋ｉ邋ｉ邋＃＂＊＂？．＊邋？邋—邋？．邋．邋、’邋ｉ邋ｆ；－邋＇．＊邋ｒ邋＇邋．逡逑圖２．兩組大鼠建模部位血管橫截面ＨＥ染色圖。逡逑Ａ：邋ＡＳ；Ｂ：邋ＲＳ。逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R543

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本文編號：2696711