【摘要】：目的:探討細(xì)胞自噬在晚期糖基化終末產(chǎn)物(advance glycation end products,AGEs)誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells,HAVSMCs)鈣化中的作用機(jī)制。方法:在此項(xiàng)研究中,選用第5-8代人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞分為對(duì)照組及鈣化組,鈣化組使用40mg/L AGEs誘導(dǎo)4天。使用Western Blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中OPG、OPN、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表達(dá)水平。按AGEs干預(yù)細(xì)胞的時(shí)間不同將實(shí)驗(yàn)分組為A1組(40mg/L AGEs干預(yù)1天)、A2組(40mg/L AGEs干預(yù)2天)、A3組(40mg/L AGEs干預(yù)3天)、A4組(40mg/L AGEs干預(yù)4天),分別使用Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表達(dá)水平,再使用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)LC3表達(dá)差異。ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ALP活性。然后,將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、自噬抑制組及鈣化組,自噬抑制組使用1μmol/L渥曼青霉素(Wortmannin)+40mg/L AGEs干預(yù)4天,鈣化組仍以40mg/L AGEs干預(yù)4天。Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白的表達(dá)水平。ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ALP活性。馮-庫(kù)薩染色法檢測(cè)細(xì)胞鈣化程度。為探索相關(guān)信號(hào)通路與自噬的關(guān)系,使用Western Blot法分別對(duì)照組與AGEs組中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.鈣化組OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表達(dá)水平相較對(duì)照組明顯增高(P0.05)。2.A1組、A2組、A3組、A4組中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白水平依次升高(P0.05),ALP活性也依次升高(P0.05)。各組細(xì)胞內(nèi)LC3II熒光斑點(diǎn)也隨干預(yù)時(shí)間增加而增加。3.自噬抑制組的OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白表達(dá)水平相較于鈣化組降低,而相較于對(duì)照組增高(P0.05)。ALP活性及馮-庫(kù)薩染色檢測(cè)的細(xì)胞鈣化程度也呈此趨勢(shì)。4.相較于對(duì)照,AGEs組的PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平增高(P0.05)。結(jié)論:1.AGEs誘導(dǎo)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化與自噬,且呈時(shí)間依耐性。2.自噬促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化。3.AGEs可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)自噬從而促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化。
【圖文】：

- 23 -細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色：A、B、C 為細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下形態(tài)，，放為 40 倍、100 倍和 200 倍 D:在激光共聚焦顯微鏡下熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-S 1 Cell morphology and immunofluorescence：A, B, and C are the morphology nder an inverted phase contrast microscope, and the magnifications are 40, 100mes respectively. D: Fluorescence detection of α-SMA under a laser concope.Es 對(duì) HAVSMCs 鈣化的影響 HAVSMCs 分別加入等量的生理鹽水、40mg/L AGEs 培養(yǎng) 4

- 25 -estern Blot 法測(cè)得細(xì)胞內(nèi) LC3II、Becl1 表示 AGEs 組與對(duì)照組相比較：Figure shows the expression levels Western Blot. Note: **P<0.01；***P<with the control group.干預(yù)不同時(shí)間對(duì) HAVSMCs 自噬、AVSMCs 加入 40mg/LAGEs，分（A3 組）、4 天（A4 組）。提取噬相關(guān)蛋白 LC3II、Beclin1、P6Control AGEs
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2693856