【摘要】：目的:本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)來源的exosomes(hucMSCs-exosomes)能夠有效修復(fù)急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)心肌損傷,但其具體作用機(jī)制不明。本研究將在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討hucMSCs-exosomes修復(fù)心肌損傷的潛在機(jī)制。方法:采取組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)hucMSCs并收集培養(yǎng)上清;超濾結(jié)合蔗糖重水梯度密度離心法分離純化hucMSCs-exosomes,并利用納米顆粒分析儀和Western blot進(jìn)行鑒定;在采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支法構(gòu)建SD大鼠AMI模型基礎(chǔ)上通過尾靜脈輸注hucMSCs-exosomes治療2天和4周后,通過超聲心動圖、HE染色和Western blot檢測hucMSCs-exosomes對心肌損傷的修復(fù)作用;體外構(gòu)建H9C2(2-1)心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷模型,乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測、臺盼藍(lán)染色和Western blot檢測hucMSCs-exosomes對心肌損傷的修復(fù)作用;同時,Western blot檢測hucMSCs-exosomes修復(fù)心肌損傷過程中Smad7的表達(dá)變化;利用生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)節(jié)Smad7表達(dá)的miRNA,并通過定量PCR和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗證;將H9C2(2-1)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimics再缺血缺氧48h,通過Western blot檢測Smad7、Bax和Bcl-2的表達(dá)以及LDH釋放檢測,分析exosomes修復(fù)心肌損傷的可能機(jī)制。結(jié)果:本研究成功分離hucMSCs及hucMSCs-exosomes,納米顆粒分析顯示hucMSCs-exosomes直徑在134nm左右,最終濃度約為4.17±0.22×10~(10) particles/ml,表達(dá)CD9、CD63和CD81等exosomes相關(guān)蛋白標(biāo)志物;體內(nèi)hucMSCs-exosomes輸注能夠提高SD大鼠AMI模型心臟的收縮能力,改善心肌損傷;體外hucMSCs-exosomes能明顯抑制H9C2(2-1)心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡;并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外心肌損傷后Smad7表達(dá)量明顯下降,而hucMSCs-exosomes能上調(diào)損傷心肌細(xì)胞的Smad7表達(dá);生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明miR-125b-5p調(diào)節(jié)Smad7的表達(dá),使用miR-125b-5p mimics轉(zhuǎn)染H9C2(2-1)心肌細(xì)胞再缺氧48h后,相比較于MNC+hypoxia組,miR-125b-5p mimics+hypoxia組的心肌細(xì)胞表達(dá)Smad7明顯下調(diào),并導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷更加明顯,hucMSCs-exosomes在一定程度上緩解了這種現(xiàn)象。結(jié)論:HucMSCs-exosomes能夠有效修復(fù)AMI心肌損傷,其可能的機(jī)制是hucMSCs-exosomes通過抑制miR-125b-5p上調(diào)Smad7表達(dá)促進(jìn)心肌修復(fù)。
【圖文】：

然后保存到-80 C。制備 12%的 SDS-PAGE 凝膠，將g 蛋白上樣量進(jìn)行加樣，電泳（積層膠 80V，分離膠 120V），，膠下沿進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白用 350mA 恒流 90min 電轉(zhuǎn)到 PVDF脫脂牛奶封閉2h，按照抗體說明書將抗體稀釋，蛋白條帶4 C 過×TBS/T 在搖床上清洗三次，每次 10min。再用相對應(yīng)的二抗（記）37 C 孵育 1h，1×TBS/T 洗膜。最后使用超敏 ECL 發(fā)光系分析蛋白表達(dá)情況。ucMSCs 的形態(tài)特征顯微鏡下觀察 hucMSCs（第三代）呈均勻分布的長梭狀生長（

圖 3.2 hucMSCs-exosomes 經(jīng) NTA 檢測的結(jié)果A、B. hucMSCs-exosomes 經(jīng) NTA 分析的顆粒大小、濃度分布及其百分比C. 不同批次 hucMSCs-exosomes 的蛋白濃度及微粒濃度Fig 3.2 The results of hucMSCs-exosomes detected by NTAA. Particle size distribution and B. particle concentration were analyzed by nanoparticacking analysis. C. Protein concentration and particle concentration of hucMSCs-exosomevarious batches..3 HucMSCs-exosomes 表達(dá)分子標(biāo)志物分 別 提 取 分 離 hucMSCs-exosomes 后 的 hucMSCs-CM 、 hucMSCcMSCs-exosomes 總蛋白，Western blot 檢測 exosomes 的相關(guān)標(biāo)志物 CD9、C CD81，結(jié)果顯示，hucMSCs-exosomes 表面三種蛋白的表達(dá)均為陽性（圖 3.
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22

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本文編號：2693615