【摘要】：目的旨在探究ADSCs作為血友病A基因治療靶細胞的可能性,將一含B區(qū)缺失的人凝血因子Ⅷ基因(B-domain deleted human coagulant factorⅧ,BDDhFⅧ)的重組腺病毒載體體外感染SD(Sprague Dawley,SD)大鼠脂肪干細胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)。方法1細胞培養(yǎng)與鑒定:無菌條件下采用膠原酶消化法取SD大鼠兩側(cè)腹股溝脂肪組織并分離培養(yǎng)ADSCs,傳至P3代用MTT法檢測細胞生長曲線;流式細胞儀檢測細胞表面標志;成骨/成脂誘導(dǎo)劑檢測干細胞多向分化潛能。2實驗分組:A組為Ad-BDDhFⅧ-GFP感染ADSCs組,B組為Ad-GFP感染ADSCs組,C組為正常培養(yǎng)ADSCs組;3采用CCK-8法檢測三組感染后細胞生長情況,ELISA法檢測細胞上清中FⅧ抗原表達水平,RT-PCR及Western blot分別檢測感染后三組細胞內(nèi)BDDhFⅧ基因和蛋白表達情況。結(jié)果1經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)的P3代細胞呈螺旋狀、梭型排列,MTT法檢測其生長曲線呈倒“S”形;流式細胞學(xué)檢測P3代細胞CD29(99.05%)、CD90(97.82%)、CD44(92.41%)陽性表達,CD45(8.38%)陰性表達;經(jīng)成脂誘導(dǎo)14d后,Oil Red O染色呈陽性;成骨誘導(dǎo)7d后ALP染色呈深藍色,成骨誘導(dǎo)30d后,茜素紅染色提示礦化結(jié)節(jié)。2重組腺病毒載體Ad-BDDhFⅧ-GFP感染ADSCs24h后可見綠色熒光,72h熒光表達強度最強,最佳MOI為350。3 CCK-8檢測感染后三組對細胞仍呈倒“S”曲線生長。4 ELISA結(jié)果顯示三組感染ADSCs72h后,A組hFⅧAg表達(140.26±2.29)明顯高于B組(99.95±1.05)與C組(80.02±0.21),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5 RT-PCR結(jié)果顯示:三組感染ADSCs后72hA組有BDDhFⅧ基因表達;B、C組無BDDhFⅧ基因表達。6Western blot檢測示三組感染ADSCs72h后,A組hFⅧ蛋白表達(1.10±0.57)明顯高于B組(0.60±0.20)與C組(0.33±0.12),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1腺病毒攜帶的B區(qū)結(jié)構(gòu)域缺失的人凝血因子Ⅷ基因載體可成功感染SD大鼠ADSC。2感染后的細胞能夠有效的表達人凝血因子FⅧ。圖9幅;表4個;參61篇。
【圖文】：

圖 1 倒置顯微鏡下 ADSCs 的形態(tài)（×100）A：原代培養(yǎng) 48h；B：原代培養(yǎng) 7d；C：3 代ADSCsFig.1 Morphology of cultured ADSCs(Inverted microscope, ×100). A: Primary culture at 48hours; B:Primary culture at 7 days; C: Third Generation culture.

圖 2 第三代 ADSCs 生長曲線Fig.2 Growth curve of third generation ADSCs.檢測 ADSCs 表面標志：P1 代細胞 CD45 表達陰性為 1.29%，CD90、C
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R554.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王詩軒;楊仁池;;血友病A抑制物研究進展[J];中華血液學(xué)雜志;2017年05期

2 燕玲;曾小菁;;血友病基因治療進展[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2015年01期

3 馬洪斌;李運祥;王銘倫;;腺病毒攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白14基因轉(zhuǎn)染脂肪干細胞修復(fù)損傷關(guān)節(jié)軟骨[J];中國組織工程研究;2015年01期

4 袁福康;陸信武;秦金保;彭智猷;葉開創(chuàng);楊芯蕊;黃麗佳;蔣米爾;;綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪干細胞治療后肢缺血的實驗研究[J];中國血管外科雜志(電子版);2014年04期

5 李艷杰;陳，

本文編號：2683128