發(fā)布時(shí)間：2020-05-27 04:40

【摘要】：背景和目的:肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary Arteria Hypertension,PAH)是一種由多因素引起的肺血管功能及結(jié)構(gòu)異常,導(dǎo)致肺血管阻力增加,引起肺動(dòng)脈壓異常升高的臨床綜合征。低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hyper-tension,HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能導(dǎo)致右心肥大及右心功能不全,最終導(dǎo)致不可逆的右心衰竭。HPH是許多心肺疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一,如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心臟病和慢性高原病等。目前針對(duì)HPH的治療仍以原發(fā)病的治療為主,而存在的一些治療手段如血管擴(kuò)張藥物,氧療,靶向藥物等不能有效控制HPH的進(jìn)展。因此,研究HPH的發(fā)病機(jī)理,對(duì)防治和治療與其相關(guān)的心肺疾病具有重要的臨床意義。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)是構(gòu)成肺動(dòng)脈壁的主要細(xì)胞,位于血管壁的中層,能夠維持血管結(jié)構(gòu)的完整性和介導(dǎo)對(duì)低氧的反應(yīng),與HPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PASMCs其分化呈可逆狀態(tài)并且具有較強(qiáng)的可塑性,這與骨骼肌和心肌細(xì)胞不同。人們根據(jù)其功能和結(jié)構(gòu)不同,將其分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型)兩種。PASMCs受到多種因素的刺激時(shí)會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,即從有收縮功能的分化表型轉(zhuǎn)化為有較強(qiáng)增殖和遷移能力的去分化表型,但由于表型轉(zhuǎn)化是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程,所以大量過(guò)渡的中間型可存在于同一血管壁中。近年來(lái),有研究表明,低氧可以誘導(dǎo)PASMCs表型轉(zhuǎn)化,但發(fā)生的具體機(jī)制不清楚。細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器之間的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于細(xì)胞存活至關(guān)重要,受Ras樣超家族成員的調(diào)節(jié)。這個(gè)超家族包括Ras、Rho、Arf、Ran和Rab亞家族。Rab蛋白作為最大的家族成員,由約200個(gè)氨基酸組成,蛋白相對(duì)分子量約20 000-29 000Da,各成員之間有相似的結(jié)構(gòu)和功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有60多種Rab蛋白在人類中表達(dá),幾乎存在于所有與膜有關(guān)的真核細(xì)胞的細(xì)胞器中,在不同的膜上有不同的Rab蛋白,每個(gè)細(xì)胞器中至少一個(gè)或多個(gè)Rab蛋白。細(xì)胞內(nèi)膜腔之間的運(yùn)輸分為囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定和融合,而Rab蛋白作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_(kāi)關(guān),在各個(gè)階段都起到了作用。Rab6作為Rab蛋白家族的成員之一,主要存在于高爾基體上,能參與調(diào)節(jié)多種蛋白在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊環(huán)境。近期有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以調(diào)節(jié)表型轉(zhuǎn)化。因此,在低氧引起表型轉(zhuǎn)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)程中,Rab6能否通過(guò)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控來(lái)影響PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化需要進(jìn)一步的研究。綜上所述,本研究的目的是研究Rab6是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs的表型轉(zhuǎn)化,并探討其在低氧過(guò)程中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。方法:1、將大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)分為低氧(1%02)Oh組和低氧12h、24h、48h組,采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)α-SMA、VIM、Rab6和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78的定量變化和免疫熒光檢測(cè)α-SMA、VIM和GRP78定位變化。2、應(yīng)用熒光顯微鏡觀察RPASMCs轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的siRNA的效率;實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組,NC siRNA 組、Rab6 siRNA1 組、Rab6 siRNA2 組、Rab6 siRNA3 組,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和 WB 檢測(cè) mRNA 和目的蛋白的抑制率。3、利用Rab6 siRNA沉默RPASMCs中Rab6的表達(dá)后低氧培養(yǎng),應(yīng)用WB和免疫熒光檢測(cè)RPASMCs表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子α-SMA、VIM和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78的定量和定位變化。結(jié)果:1、與低氧Oh組比較,RPASMCs經(jīng)1%O2低氧處理12h、24h和48h后,低氧48h后表型標(biāo)志基因蛋白α-SMA的表達(dá)下調(diào),VIM的表達(dá)上調(diào);Rab6表達(dá)上調(diào);RPASMCs經(jīng)低氧處理12h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78表達(dá)上升最明顯。2、Rab6 siRNA能夠成功轉(zhuǎn)染至RPASMCs中,并且顯著抑制了 RPASMCs中Rab6的表達(dá)。3、與低氧NC siRNA比較,低氧轉(zhuǎn)染Rab6 siRNA后,RPASMCs中表型標(biāo)志基因蛋白α-SMA的表達(dá)上調(diào),VIM的表達(dá)下調(diào);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:1、低氧能促進(jìn)RPASMCs表型轉(zhuǎn)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激比表型轉(zhuǎn)化更早發(fā)生。2、Rab6參與了低氧誘導(dǎo)的RPASMCs表型轉(zhuǎn)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程。
【圖文】：

圖２－１－１低氧對(duì)ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響逡逑Ａ．邐ＷＢ?lián)鞙y(cè)低氧處理ＲＰＡＳＭＣｓ后不同時(shí)間點(diǎn)表型標(biāo)志蛋白ａ－ＳＢ．表型標(biāo)志蛋白ａ－ＳＭＡ和ＶＩＭ的表達(dá)情況的半定量分析（與Ｏｈ２．１．２．２低氧處理不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標(biāo)志蛋白免疫熒光結(jié)果顯示，常氧狀態(tài)下，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，２４ｈ、４８ｈ處理后與低氧Ｏｈ組對(duì)比，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變肌絲減少，熒光逐漸減弱，ａ－ＳＭＡ在胞漿內(nèi)表達(dá)減１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ處理后與低氧Ｏｈ組對(duì)比，熒光逐漸增胞內(nèi)定位無(wú)改變（圖２－１－２Ａ，，邋Ｂ）。逡逑

圖２－１－２低氧對(duì)ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標(biāo)志蛋白定位及表達(dá)的影響逡逑（綠色熒光標(biāo)記蛋白，藍(lán)色標(biāo)記ＤＡＰＩ染色的細(xì)胞核）逡逑Ａ．免疫熒光檢測(cè)低氧對(duì)ＲＰＡＳＭＣｓ中ｃｔ－ＳＭＡ的影響。放大率：１０００倍。逡逑Ｂ．免疫熒光檢測(cè)低氧對(duì)ＲＰＡＳＭＣｓ中ＶＩＭ的影響。放大率：１０００倍。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R544.1

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本文編號(hào)：2682963