【摘要】：背景和目的:肺動脈高壓(Pulmonary Arteria Hypertension,PAH)是一種由多因素引起的肺血管功能及結構異常,導致肺血管阻力增加,引起肺動脈壓異常升高的臨床綜合征。低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hyper-tension,HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能導致右心肥大及右心功能不全,最終導致不可逆的右心衰竭。HPH是許多心肺疾病的重要發(fā)病機制之一,如慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心臟病和慢性高原病等。目前針對HPH的治療仍以原發(fā)病的治療為主,而存在的一些治療手段如血管擴張藥物,氧療,靶向藥物等不能有效控制HPH的進展。因此,研究HPH的發(fā)病機理,對防治和治療與其相關的心肺疾病具有重要的臨床意義。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)是構成肺動脈壁的主要細胞,位于血管壁的中層,能夠維持血管結構的完整性和介導對低氧的反應,與HPH的發(fā)生發(fā)展密切相關。PASMCs其分化呈可逆狀態(tài)并且具有較強的可塑性,這與骨骼肌和心肌細胞不同。人們根據(jù)其功能和結構不同,將其分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型)兩種。PASMCs受到多種因素的刺激時會發(fā)生表型轉化,即從有收縮功能的分化表型轉化為有較強增殖和遷移能力的去分化表型,但由于表型轉化是一個漸進的過程,所以大量過渡的中間型可存在于同一血管壁中。近年來,有研究表明,低氧可以誘導PASMCs表型轉化,但發(fā)生的具體機制不清楚。細胞內(nèi)各細胞器之間的轉運對于細胞存活至關重要,受Ras樣超家族成員的調(diào)節(jié)。這個超家族包括Ras、Rho、Arf、Ran和Rab亞家族。Rab蛋白作為最大的家族成員,由約200個氨基酸組成,蛋白相對分子量約20 000-29 000Da,各成員之間有相似的結構和功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有60多種Rab蛋白在人類中表達,幾乎存在于所有與膜有關的真核細胞的細胞器中,在不同的膜上有不同的Rab蛋白,每個細胞器中至少一個或多個Rab蛋白。細胞內(nèi)膜腔之間的運輸分為囊泡的形成、轉運、粘附、錨定和融合,而Rab蛋白作為囊泡運輸?shù)姆肿娱_關,在各個階段都起到了作用。Rab6作為Rab蛋白家族的成員之一,主要存在于高爾基體上,能參與調(diào)節(jié)多種蛋白在細胞膜上的轉運,同時影響內(nèi)質網(wǎng)的折疊環(huán)境。近期有研究表明,內(nèi)質網(wǎng)應激也可以調(diào)節(jié)表型轉化。因此,在低氧引起表型轉化和內(nèi)質網(wǎng)應激的過程中,Rab6能否通過對內(nèi)質網(wǎng)應激的調(diào)控來影響PASMCs發(fā)生表型轉化需要進一步的研究。綜上所述,本研究的目的是研究Rab6是否通過內(nèi)質網(wǎng)應激調(diào)控低氧誘導的大鼠PASMCs的表型轉化,并探討其在低氧過程中對內(nèi)質網(wǎng)應激的作用。方法:1、將大鼠肺動脈平滑肌細胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)分為低氧(1%02)Oh組和低氧12h、24h、48h組,采用蛋白質印跡法(Western Blot,WB)檢測α-SMA、VIM、Rab6和內(nèi)質網(wǎng)應激相關分子GRP78的定量變化和免疫熒光檢測α-SMA、VIM和GRP78定位變化。2、應用熒光顯微鏡觀察RPASMCs轉染Cy3標記的siRNA的效率;實驗設空白組,NC siRNA 組、Rab6 siRNA1 組、Rab6 siRNA2 組、Rab6 siRNA3 組,應用逆轉錄-多聚酶鏈反應(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和 WB 檢測 mRNA 和目的蛋白的抑制率。3、利用Rab6 siRNA沉默RPASMCs中Rab6的表達后低氧培養(yǎng),應用WB和免疫熒光檢測RPASMCs表型轉化標志分子α-SMA、VIM和內(nèi)質網(wǎng)應激相關分子GRP78的定量和定位變化。結果:1、與低氧Oh組比較,RPASMCs經(jīng)1%O2低氧處理12h、24h和48h后,低氧48h后表型標志基因蛋白α-SMA的表達下調(diào),VIM的表達上調(diào);Rab6表達上調(diào);RPASMCs經(jīng)低氧處理12h后,內(nèi)質網(wǎng)應激相關分子GRP78表達上升最明顯。2、Rab6 siRNA能夠成功轉染至RPASMCs中,并且顯著抑制了 RPASMCs中Rab6的表達。3、與低氧NC siRNA比較,低氧轉染Rab6 siRNA后,RPASMCs中表型標志基因蛋白α-SMA的表達上調(diào),VIM的表達下調(diào);內(nèi)質網(wǎng)應激相關分子GRP78表達下調(diào)。結論:1、低氧能促進RPASMCs表型轉化和內(nèi)質網(wǎng)應激,且內(nèi)質網(wǎng)應激比表型轉化更早發(fā)生。2、Rab6參與了低氧誘導的RPASMCs表型轉化和內(nèi)質網(wǎng)應激過程。
【圖文】：

圖２－１－１低氧對ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標志蛋白表達的影響逡逑Ａ．邐ＷＢ?lián)鞙y低氧處理ＲＰＡＳＭＣｓ后不同時間點表型標志蛋白ａ－ＳＢ．表型標志蛋白ａ－ＳＭＡ和ＶＩＭ的表達情況的半定量分析（與Ｏｈ２．１．２．２低氧處理不同時間點對ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標志蛋白免疫熒光結果顯示，常氧狀態(tài)下，細胞呈長梭形，２４ｈ、４８ｈ處理后與低氧Ｏｈ組對比，細胞形態(tài)發(fā)生改變肌絲減少，熒光逐漸減弱，ａ－ＳＭＡ在胞漿內(nèi)表達減１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ處理后與低氧Ｏｈ組對比，熒光逐漸增胞內(nèi)定位無改變（圖２－１－２Ａ，，邋Ｂ）。逡逑

圖２－１－２低氧對ＲＰＡＳＭＣｓ中表型標志蛋白定位及表達的影響逡逑（綠色熒光標記蛋白，藍色標記ＤＡＰＩ染色的細胞核）逡逑Ａ．免疫熒光檢測低氧對ＲＰＡＳＭＣｓ中ｃｔ－ＳＭＡ的影響。放大率：１０００倍。逡逑Ｂ．免疫熒光檢測低氧對ＲＰＡＳＭＣｓ中ＶＩＭ的影響。放大率：１０００倍。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1

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