【摘要】：背景和目的NLRP3炎性小體的激活是動脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素。巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)激活NLRP3炎性小體,并隨后分泌促炎介質和泡沫細胞形成。Poly(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是DNA損傷的分子傳感器,在許多真核細胞(包括單核/巨噬細胞)中存在豐富的PARP酶。有證據(jù)表明,PARP過度激活是致多種炎癥性疾病包括動脈粥樣硬化的有害因素。本研究旨在探討1)Ox-LDL是否激活THP-1單核/巨噬細胞中PARP酶的活化;2)新近FDA批準的抗癌藥物奧拉帕利(0l apar ib)通過抑制PARP是否減弱NLRP3炎性小體的活性和隨后的促炎細胞因子的分泌、泡沫細胞形成和細胞的黏附;3)奧拉帕利介導的NLRP3炎性小體的抑制是否涉及NLRP3炎性小體激活的啟動和激活的兩個信號步驟。方法1.本課題的絕大部分實驗是用被大家廣泛應用的人單核巨噬細胞系THP-1細胞。THP-1細胞系懸浮培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。THP-1細胞經(jīng)或不經(jīng)奧拉帕利、MCC950、Ox-LDL處理,而分為對照組、Olaparib組、MCC組、Ox-LDL 組、Olaparib+Ox-LDL 組、MCC+Ox-LDL 組、Olaparib+MCC+Ox-LDL 共七組。2.免疫蛋白印跡實驗(Western blot)在本課題中被廣泛應用于蛋白質表達的檢測和半定量測定。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)用來檢測在NLRP3炎性小體激活后分至培養(yǎng)基中的白細胞介素IL-1 β和IL-18的量。4.油紅0染料被用來評估泡沫細胞的形成。用福爾馬林溶液固定后,用新鮮制備的油紅0染料液對THP-1細胞進行染色。染色后的THP-1細胞在倒置顯微鏡下進行觀察,并對拍攝的圖像中的陽性泡沫細胞進行定量評估。5.細胞粘附試驗被用來評價THP-1單核巨噬細胞和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的粘附,這一體外實驗與單核細胞粘附到血管內皮是相似的,單核巨噬細胞遷移到動脈粥樣硬化病變部位是動脈粥樣致病的早期步驟。6.常用于鑒定蛋白質相互作用共免疫沉淀(CO-IP)實驗用于評估NF-κB活性的動態(tài)變化。免疫沉淀實驗需要特異性的抗體及A/G親和珠。結果1.氧化型低密度脂蛋白以劑量和時間依賴的方式增加NLRP3炎性小體組分(NLRP3、ASC、Caspase 1)和裂解型的PARP-1的蛋白表達。2.奧拉帕利通過抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的裂解型PARP-1蛋白表達,而不抑制總PARP-1蛋白的表達。奧拉帕利還降低了氧化型低密度脂蛋白誘導的NLRP3炎性小體各組分(NLRP3、ASC、Caspase 1)的蛋白表達。與預期一致,MCC950降低氧化型低密度脂蛋白介導的NLRP3炎性小體各組分的蛋白表達,但單獨的奧拉帕利或MCC950處理組與對照組相比,NLRP3活性的沒有改變。3.氧化型低密度脂蛋白增加白細胞介素IL-1β和IL-18的蛋白表達;奧拉帕利降低氧化型低密度脂蛋白所介導的IL-1β和IL-18的蛋白表達,但單獨奧拉帕利處理組與對照組相比,IL-1β和IL-18的蛋白表達沒有改變。ELISA檢測顯示,氧化型低密度脂蛋白對IL-1 β和IL-18的分泌有明顯的促進作用,而奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的IL-1β和IL-18的分泌,但單獨應用奧拉帕利,與對照組相比,IL-1β和IL-18的分泌沒有改變。4.奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的LOX-1和CD36清道夫受體的蛋白表達,但單獨奧拉帕利處理組與對照組相比,清道夫受體的蛋白表達沒有改變。與之相應,油紅0染色實驗顯示奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的泡沫細胞的形成,而單獨的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比,泡沫細胞的形成沒有改變。5.奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的VCAM-1蛋白的表達:而單獨的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比,VCAM-1蛋白的表達沒有改變。與之相應,細胞粘附實驗顯示,奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的單核細胞與HUVEC細胞的粘附,而單獨的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比,細胞與HUVEC細胞的粘附?jīng)]有改變。6.流式細胞檢測顯示,氧化型低密度脂蛋白增加了 THP-1細胞的線粒體活性氧的生成。奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的線粒體活性氧的增加。7.氧化型低密度脂蛋白增加了 IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達,奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達;而單獨的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比,IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達沒有改變。靜息狀態(tài)下,抗Iκ B α的抗體沉淀p65和p50,p65可被抗p50和抗Iκ B α所沉淀。奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導的I κ Bα與p65和p50的共免疫沉淀率,而奧拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的單獨或聯(lián)合處理不影響p65與p50的免疫共沉淀。8.靜息狀態(tài)下,抗IκBα的抗體沉淀ReIB和p52,Rel B也可被抗p52和抗IκBα所沉淀。奧拉帕利處理組(Olaparib+Ox-LDL)降低了IKBα與ReIB和p52免疫共沉淀,而奧拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的單獨或聯(lián)合處理不影響ReIB和P52的免疫共沉淀。結論1.氧化型低密度脂蛋白增加NLRP3炎癥小體和PARP的活性,奧拉帕利通過抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白所介導的PARP和NLRP3炎癥小體的活性。2.奧拉帕利對PARP的抑制作用而抑制氧化型低密度脂蛋白介導的IL-1β和IL-18蛋白的表達和分泌的增加。3.奧拉帕利對PARP的抑制作用而抑制氧化型低密度脂蛋白所誘導的泡沫細胞形成和單核細胞與內皮細胞的粘附。4.線粒體活性氧參與了奧拉帕利所介導的氧化型低密度脂蛋白對NLRP3炎性小體的激活。5.NF-κB的激活參與了奧拉帕利介導的NLRP3炎性小體抑制,其中典型和非經(jīng)典途徑均參與了奧拉帕利介導的對Ox-LDL增強NLRP3炎癥小體活性的抑制。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

【參考文獻】

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1 Amy J Galliher-Beckley;Li-Qiong Lan;Shelly Aono;Lei Wang;Jishu Shi;;Caspase-1 activation and mature interleukin-1β release are uncoupled events in monocytes[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年02期

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本文編號：2682783