【摘要】：背景同型半胱氨酸(Homocystein,Hcy)是動脈粥樣硬化性心血管疾病的獨立危險因素,參與心血管和腦血管事件的發(fā)生。有研究已證實Hcy氧化過程中通過含有金屬的酶蛋白催化,產(chǎn)生活性氧物質,進而導致血管內皮功能障礙。此外臨床研究表明診斷為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)的患者,血漿Hcy和Cu2+的濃度同步升高,且兩者呈正相關,而此現(xiàn)象在患有心血管疾病人群中尤為常見。這表明在Hcy損傷內皮細胞過程中Cu2+起重要作用。并且隨著對Hcy-Cu復合物新的認知,發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化形成過程中Hcy-Cu復合物也起到了非常重要的作用。ZnMoS4是一種具有對銅離子極高選擇性的新型納米顆粒離子交換劑,不僅能穿透細胞膜充當細胞內的銅解毒劑,還能保持其他必須生物金屬離子的穩(wěn)態(tài)。我們前期研究已證實:與單獨Hcy、Cu2+處理培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞相比,Hcy聯(lián)合Cu2+可明顯加重對細胞的損傷,降低細胞存活率。其機制可能是Hcy依賴Cu2+作用激活糖酵解通路和NADPH氧化酶,抑制谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化系統(tǒng),生成過多ONOO-造成內皮氧化損傷。本實驗將進一步動物體內證明Hcy可聯(lián)合Cu2+對血管產(chǎn)生更嚴重的損傷和損傷的可能機制,并探討ZnMoS4對Hcy損傷大鼠主動脈的保護作用,以及推測Hcy-Cu復合物的可能分子式。第一部分Hcy損傷大鼠主動脈內皮目的:探討Hcy對大鼠主動脈具有的損傷作用。方法:建立HHcy大鼠模型,選取10只6周齡SD雄性大鼠隨機分為2組,每組5只:①正常蛋氨酸組(4.6g/kgMet);②高蛋氨酸組(7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測大鼠體重,實驗結束后眼球動脈采血檢測血清中Hcy溶度;解剖大鼠取主動脈用于血管環(huán)張力測定、HE染色、透射電鏡實驗,觀察大鼠主動脈的損傷程度;結果:與正常組相比,高蛋氨酸組主動脈內皮依賴性舒張功能減弱,主動脈內皮細胞明顯破壞并伴有線粒體損傷。結論:體內Hcy濃度增加可損傷主動脈內皮細胞。第二部分 Hcy聯(lián)合Cu2+損傷主動脈的機制研究目的:探討Hcy聯(lián)合Cu2+損傷主動脈的機制。方法:實驗一:準備30只6周齡SD雄性大鼠隨機分為6組,每組5只:①低銅對照組(1.6mg/kg Cu);②正常銅對照組(1Omg/kg Cu);③高銅對照組(300mg/kg Cu);④低銅+高蛋氨酸組(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet)⑤正常銅+高蛋氨酸組(10mg/kg Cu+7.5g/kgMet);⑥高銅+高蛋氨酸組(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測各組大鼠體重,實驗結束后解剖所有模型大鼠,活體下取出主動脈用于血管環(huán)張力測定、HE染色、透射電鏡實驗,觀察大鼠主動脈的損傷程度。實驗二:20只6周齡雄性SD大鼠隨機分為4組,每組5只:①正常銅對照組(10mg/kg Cu);②低銅+高蛋氨酸組(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet);③正常銅+高蛋氨酸組(1Omg/kg Cu+7.5g/kgMet);④高銅+高蛋氨酸組(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測各組大鼠體重,實驗結束后眼球動脈采血測血清乳酸含量,解剖所有模型大鼠活體下取出主動脈用于HE染色,免疫組化,熒光染色法檢測血管ROS及NOX活性;結果:實驗一:正常銅、低銅、高銅組大鼠主動脈血管舒張功能相似,病理結果未見主動脈內皮損傷;正常銅+高蛋氨酸組、低銅+高蛋氨酸組、高銅+高蛋氨酸組血管舒張功能較①②③組明顯減弱,且高銅+高蛋氨酸組正常銅+高蛋氨酸組低銅+高蛋氨酸組;內皮細胞破壞、線粒體損傷程度較前三組明顯增大,高銅+高蛋氨酸組正常銅+高蛋氨酸組低銅+高蛋氨酸組。實驗二:與正常對照組相比,正常銅+高蛋氨酸組、高銅+高蛋氨酸組主動脈己糖激酶Ⅱ、gult1、及NOX亞基蛋白表達含量增加、ROS和NOX活性明顯增強、內皮細胞破壞、線粒體損傷程度嚴重,且與銅濃度成正比;3-NT蛋白的表達隨著銅濃度的增加而減少。結論:血清中Cu2+的含量不影響正常Hcy對血管的作用,但在HHcy中,隨著銅含量的增加可加重Hcy對主動脈的損傷,其機制可能是是通過激活NADPH氧化酶和糖酵解途徑,產(chǎn)生ROS;同時生成過多ONOO-造成內皮細胞氧化損傷。第三部分 納米銅交換劑(ZnMoS4)對Hcy損傷主動脈的保護作用目的:探討ZnMoS4對Hcy損傷主動脈的保護作用方法:實驗一:原代提取人臍靜脈內皮細胞,將細胞分為如下四組:①正常組,②Hcy+Cu2+組,③Hcy+Cu2++四硫鉬酸鹽(TM)組(2,5,10,50uM/L),④Hcy+Cu2++納米銅離子交換劑(ZnMoS4)組(2,10,50,100uM/L),加藥處理24小時后,流式細胞儀檢測細胞存活率;同時急性藥物毒性試驗比較兩者毒性的強弱。實驗二:選取15只6周齡SD雄性大鼠隨機分為3組,每組5只:①正常對照組;②高蛋氨酸組(7.5g/kgMet);③高蛋氨酸組+納米銅螯合劑組(7.5g/kgMet+ZnMoS4):喂養(yǎng)1周后加入ZnMoS4(40ml ZnMoS4加入在2Kg鼠糧中)。每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測大鼠體重,麻醉后解剖所有模型大鼠,活體下取出主動脈用于熒光檢測儀測試血管環(huán)NOX活性、HE染色、透射電鏡實驗。結果:實驗一:Hcy+Cu2+加入不同溶度的TM和ZnMoS4均能提高細胞生存率,但ZnMoS4的毒性比TM小很多。實驗二:與高蛋氨酸組相比,高蛋氨酸+ZnMoS4組大鼠血管環(huán)NOX活性升高程度明顯減小,內皮細胞破壞、線粒體損傷程度顯著減弱。結論:ZnMoS4對Hcy損傷主動脈具有保護作用。第四部分 Hcy與Cu2+絡合物鑒定目的:鑒定Hcy-Cu2+絡合物方法:采用基質輔助激光解吸電離質譜法(MALDI-TOF)、高效液相色譜-線性離子阱質譜法(ESI-MS)和核磁共振波譜法(NMR)。結果:高效液相色譜-線性離子阱質譜法色譜圖中出現(xiàn)365.9m/z、367.9m/z、369.98m/z三個質核比相差2的峰譜,核磁共振波譜中Hcy-Cu2+絡合后峰變少、變寬并發(fā)生位移。結論:Hcy與Cu2+可形成絡合物。
【圖文】：

cy濃H度（mol/L）u圖 2.4.1 兩組 SD 大鼠血漿 Hcy 濃度：*表示高蛋氨酸組大鼠血漿 Hcy 濃度與正常組比較 p＜0.054.2 Hcy降低主動脈血管環(huán)張力通過觀察各組主動脈血管在 1μM PE 預收縮后，，對乙酰膽堿的舒張反應（ACH 濃度 10-9至 10-5mol/L）。結果顯示：高蛋氨酸組較正常蛋氨酸組舒分比下降，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），說明 Hcy 可損傷 SD 大鼠主動皮依賴性舒張功能。0102030正常蛋氨酸組 高蛋氨酸組

第 2 章 同型半胱氨酸對大鼠主動脈的損傷2.4.3 Hcy損傷主動脈內皮獲取 HHcy 大鼠主動脈用于 HE 染色和透射電鏡檢測，我們發(fā)現(xiàn) HE 染色結果中高蛋氨酸組大鼠較正常蛋氨酸組主動脈內皮細胞缺損、脫落明顯，平滑肌細胞細胞核大小不一、胞漿染色不均，排列紊亂（圖 2.4.3A）。并且通過透射電鏡觀察 SD 大鼠主動脈內皮細胞線粒體情況可知：正常蛋氨酸組可見內皮細胞線粒體形態(tài)正常，體積較大，嵴較清晰；而高蛋氨酸組內皮細胞線粒體形態(tài)腫脹，嵴略少（圖 2.4.3B）。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2682792