【摘要】：目的探討缺鋅對(duì)于心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的影響,以闡明缺鋅引起心肌細(xì)胞損傷的信號(hào)通路及機(jī)制。方法1選取大鼠胚胎心臟組織來(lái)源的H9c2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)用鋅離子(Zn~(2+))螯合劑四吡啶甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetrakis Ethylenediamine,TPEN)建立缺鋅模型。線(xiàn)粒體熒光探針TMRE(100 nM)預(yù)染細(xì)胞,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察TPEN對(duì)線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,?Ψm)的影響,進(jìn)而判斷線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開(kāi)放情況;應(yīng)用Western blot法檢測(cè)結(jié)合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP),最終確定TPEN的最適濃度。2 Western blot法檢測(cè)TPEN對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)伴侶BIP和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein,GRP 94)的影響,觀察外源性鋅(ZnCl_2)能否抑制此作用。3觀察缺鋅對(duì)ERS感受器肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)表達(dá)的影響。4觀察IRE1抑制劑STF083010對(duì)IRE1表達(dá)的影響以確定最適濃度。5觀察STF083010是否抑制缺鋅引起的IRE1表達(dá)。6激光掃描共聚焦顯微鏡觀察TPEN對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針ER Tracker熒光強(qiáng)度的影響。7觀察TPEN對(duì)線(xiàn)粒體紅色熒光探針TMRE熒光強(qiáng)度的影響。8應(yīng)用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果1不同濃度(0.01、0.1、1、10、100μM)TPEN處理H9c2細(xì)胞20 min,與對(duì)照組(100.0±4.1%)相比,1、10、100μM TPEN使TMRE紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱,100μM TPEN使熒光強(qiáng)度減弱最為明顯,10μM TPEN對(duì)TMRE熒光強(qiáng)度影響較小(67.8±2.3%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅能夠引起線(xiàn)粒體膜電位降低,即誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放;Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組(100±3.8%)相比,10μM TPEN處理細(xì)胞20 min后使BIP的表達(dá)明顯增加(210.2±7.7%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅引起ERS,后續(xù)實(shí)驗(yàn)TPEN濃度均采用10μM。2 Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組(100±2.2%)相比,TPEN處理20 min使BIP表達(dá)明顯增加(215.1±8.3%),此作用被ZnCl_2所逆轉(zhuǎn)(163.2±9.5%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與正常對(duì)照組(100±3.9%)相比,TPEN處理20 min使GRP 94表達(dá)明顯增加(194.1±6.2%),此作用同樣被ZnCl_2所逆轉(zhuǎn)(156.6±4.9%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),上述結(jié)果表明,缺鋅引起ERS,補(bǔ)充外源性鋅(5μM ZnCl_2)可以防止ERS。3 Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組(100±1.5%)相比,TPEN處理20min后,IRE1表達(dá)明顯增加(188.4±3.9%),此作用被ZnCl_2所逆轉(zhuǎn)(133.0±7.8%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅可能激活了IRE1。4不同濃度(0.1、1、5、10、30、45μM)STF083010處理H9c2細(xì)胞30 min后,與正常對(duì)照組(100±8.1%)相比,1μM STF083010處理細(xì)胞使IRE1表達(dá)明顯降低(59.1±2.4%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明STF083010能夠抑制IRE1的表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)STF083010濃度均采用1μM。5與正常對(duì)照組(100±3.8%)相比,TPEN處理20 min后,IRE1表達(dá)明顯增加(204.2±7.3%),此作用被STF083010所逆轉(zhuǎn)(152.2±3.3%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),進(jìn)一步說(shuō)明缺鋅激活了IRE1。6與對(duì)照組(100.00?3.0)相比,TPEN使ER Tracker紅色熒光強(qiáng)度明顯減少(59.15?3.2),STF083010明顯抑制TPEN引起的紅色熒光強(qiáng)度的減少(79.4±3.8%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅通過(guò)IRE1導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。7與對(duì)照組(100.00?4.5)相比,TPEN使TMRE紅色熒光強(qiáng)度明顯減少(61.35?2.7),STF083010明顯抑制TPEN引起的TMRE熒光強(qiáng)度的減少(79.6±2.2%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅通過(guò)IRE1導(dǎo)致mPTP開(kāi)放。8 LDH細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(100.00?0.0)相比,TPEN使細(xì)胞毒性明顯增加(195.17?7.4),STF083010明顯抑制TPEN產(chǎn)生的細(xì)胞毒性(150.0±4.0%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明缺鋅通過(guò)IRE1使細(xì)胞毒性增加。結(jié)論缺鋅引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,通過(guò)感受器IRE1導(dǎo)致mPTP開(kāi)放,使細(xì)胞毒性增加,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損。補(bǔ)充外源性鋅可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,保護(hù)心肌細(xì)胞。圖11幅;表10個(gè);參172篇。
【圖文】：

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文表 1 蛋白定量體積表Table 1 Protein quantitative volume tableA B C D E F G 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（μl）0 1 2 4 8 12 16 PBS（μl） 20 19 18 16 12 8 4 BCA 工作液（μl）200 200 200 200 200 200 200 待測(cè)蛋白（μl）2 2 2 2 2 2 2 PBS（μl） 18 18 18 18 18 18 18 BCA 工作液（μl）200 200 200 200 200 200 200

- 15 -注：*P<0.05 vs. Baseline圖 2 TPEN 對(duì)線(xiàn)粒體膜電位（mPTP 開(kāi)放）的影響Fig.2 Effect of TPEN on mitochondrial membrane potential（mPTP opening）1.2.2 Western blot 觀察缺鋅對(duì) BIP 的影響為了探究 TPEN 造成細(xì)胞損傷的最適濃度，實(shí)驗(yàn)中我們用 Western blot 法檢測(cè)BIP 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（100±3.8%）相比，10 μM TPEN 處理細(xì)胞 20 min 后使 BIP 的表達(dá)明顯增加（210.2±7.7%），，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明缺鋅引起 ERS，如表 3、圖 3 所示，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn) TPEN 濃度采用10 μM。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 賀永貴;李王芳;伊紅麗;鄭桓;習(xí)瑾昆;;黃芪甲苷抑制GSK-3β活性介導(dǎo)大鼠心肌缺血/再灌注損傷作用的線(xiàn)粒體機(jī)制研究[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2014年03期

2 潘蓉蓉;金永喜;朱文宗;;PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2013年01期

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1 李王芳;鋅離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑誘導(dǎo)心肌保護(hù)中的作用[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 鄭志剛;IRE1分子通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)預(yù)應(yīng)激條件下對(duì)肝細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2682257