【摘要】：流行病學研究發(fā)現(xiàn),胎兒發(fā)育期子宮環(huán)境不良會導致成年期患心肌肥大、高血壓、Ⅱ型糖尿病及認知障礙等一系列嚴重疾病的易感性增加。婦女在懷孕期間容易出現(xiàn)焦慮、抑郁等情志應激狀態(tài)。孕婦在產(chǎn)前應激的狀態(tài)下會釋放大量糖皮質(zhì)激素,通過胎盤屏障進入胎兒血液循環(huán),嚴重影響子宮內(nèi)胚胎發(fā)育。本課題組前期研究中,采用應激激素皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT)作用于雞胚來模擬孕婦產(chǎn)前應激狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)激素能夠誘導雞胚心臟心肌肥大。然而,關于CORT是如何引起心肌肥大的具體機制尚不明確。因此,本研究在前期工作基礎上,采用CORT負荷雞胚模型和H9C2心肌細胞模型,深入研究情志應激誘導胚胎心肌肥大的分子生物學機制。首先,我們采用CORT構(gòu)建了H9C2心肌細胞肥大的細胞模型,并通過檢測肥大相關基因表達及細胞形態(tài)變化來驗證此模型的有效性。實驗結(jié)果顯示,200μM的CORT處理H9C2細胞48 h后,肥大相關基因心房利鈉因子相關肽(ANP)及B型利鈉肽(BNP)的表達明顯增加,且伴有細胞橫截面積增大,肌節(jié)化增多等形態(tài)特征。同時,我們使用Mitored tracker檢測H9C2細胞線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn),CORT處理組線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,且呈短碎狀聚集在核周圍。進一步的透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),H9C2細胞CORT處理組線粒體基質(zhì)顏色加深,嵴結(jié)構(gòu)腫漲,邊界模糊不清,明顯短小。此外,通過檢測與線粒體功能相關的指標,我們發(fā)現(xiàn)CORT能夠引起線粒體復合物酶Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性降低,MDA水平增加,ATP含量減少。以上研究結(jié)果表明,CORT誘導心肌肥大的原因可能與線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷有關。Mfn2是線粒體融合過程中的關鍵蛋白,在維持線粒體正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中起重要作用。前期研究中我們發(fā)現(xiàn),Mfn2蛋白表達在CORT應激誘導的雞胚心肌肥大模型中明顯異常,可能與該心肌肥大模型的機制有關。本研究系統(tǒng)考察了CORT對Mfn2蛋白表達水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),H9C2細胞及雞胚心臟組織在CORT作用下Mfn2蛋白表達增加。但對Mfn2的細胞器定位研究發(fā)現(xiàn),CORT作用下線粒體中Mfn2蛋白表達均明顯減少,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Mfn2蛋白表達增加。同時,我們還利用蛋白合成抑制劑CHX抑制蛋白合成途徑而蛋白降解途徑開放,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CORT可以加快線粒體Mfn2蛋白的降解速率,因此我們推測線粒體上的Mfn2蛋白可能發(fā)生了降解。目前蛋白質(zhì)降解的途徑主要包括泛素-蛋白酶體途徑及溶酶體自噬途徑。我們采用蛋白酶體降解抑制劑MG132和自噬抑制劑3-MA預保護進行比較研究發(fā)現(xiàn),自噬抑制劑并不能恢復CORT引起的線粒體Mfn2蛋白減少,因此我們推測線粒體上Mfn2可能發(fā)生了泛素化降解。我們進一步對線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Mfn2的泛素化水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體上Mfn2泛素化水平增加,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Mfn2泛素化水平無明顯變化。本研究接下來進一步研究線粒體上Mfn2泛素化降解的發(fā)生機制。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的激活需要E3連接酶特異性識別底物分子中暴露的Lys位點,當?shù)孜锏鞍卓臻g構(gòu)象發(fā)生變化時,就可能引起泛素化作用的激活。因此,我們推測線粒體中可能存在某種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中沒有的特異性蛋白,能與線粒體上的Mfn2相互作用,從而使線粒體上Mfn2被泛素標記,引起線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Mfn2泛素化水平的差異。為了進一步探究線粒體中可能存在的與Mfn2相互作用的特異性蛋白,我們通過NCBI Protein數(shù)據(jù)庫篩選出了潛在作用蛋白,并用CELLO亞細胞器定位系統(tǒng)對這些蛋白進行亞細胞器定位預測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC25A38(Appoptosin)蛋白能夠與Mfn2相互作用,且只分布在線粒體上而幾乎不存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。通過Western blotting、免疫共沉淀(CO-immunoprecipitation,CO-IP)及免疫熒光共聚焦共定位等技術我們發(fā)現(xiàn),CORT顯著增加Appoptosin的蛋白表達水平,促進Mfn2與Appoptosin蛋白之間的相互作用。采用小RNA干擾技術沉默Appoptosin表達后,CORT處理組線粒體Mfn2的表達水平明顯上調(diào)而線粒體Mfn2泛素化水平顯著下降,伴隨線粒體復合物酶活性及ATP含量增加及肥大相關基因表達下調(diào)。以上結(jié)果提示,CORT引起線粒體Mfn2的泛素化降解是通過Appoptosin介導的。綜合以上,CORT能夠誘導心肌細胞發(fā)生肥大并伴隨線粒體呼吸鏈復合物活性降低,線粒體呈點狀斷裂,基質(zhì)顏色加深,嵴結(jié)構(gòu)腫漲。同時,CORT能夠誘導線粒體蛋白Appoptosin的表達水平上調(diào),促進Mfn2與Appoptosin之間的相互結(jié)合,導致線粒體Mfn2泛素化水平增加,線粒體Mfn2蛋白表達減少;而沉默Appoptosin能夠改善CORT誘導的線粒體Mfn2蛋白減少、線粒體損傷及心肌肥大。證明CORT是通過調(diào)控Appoptosin介導的線粒體Mfn2泛素化從而導致線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷,最終引起心肌肥大。
【圖文】：

[17]。如圖1所示，心肌肥大按照心室壁厚度及心室腔容積可分為離心性肥大（Eccentrichypertrophy）和向心性肥大（Concentric hypertrophy），當心臟長期處于容量超負荷狀態(tài)時，就會表現(xiàn)為心臟重量增加，心室腔擴大，心室壁變薄，心肌細胞伸長的離心性肥大表型。當心臟發(fā)生向心性肥大時，其心肌細胞間質(zhì)網(wǎng)絡密度及心室壁厚度增加而左心室腔容積減少[18, 19]。事實上，心肌肥大在發(fā)展初期是機體為了補償內(nèi)部代謝失調(diào)引起的心功能動力不足而發(fā)生的自身適應性心肌重塑反應，這種代償性的肥大能夠增加心臟收縮單元數(shù)量、降低心室壁應力，被認為對機體是有益的[20]。但是長期的代償性反應將引起心臟收縮功能失調(diào)、間質(zhì)纖維化、基因表達及電生理特征異常

圖 2 皮質(zhì)酮對雞胚心臟的影響[37]體與心肌肥大知，心臟是一個高耗能器官，人體心臟每天需消耗大概 6 kg）以維持機體正�；顒印５募〖毎麑� ATP 的儲存能力較低且足心臟長時間收縮舒張所需的能量，因此心肌必須不斷產(chǎn)生常功能[21]。線粒體被稱為“細胞發(fā)電廠”，占心肌細胞體積的胞中 90%以上 ATP 來自線粒體氧化磷酸化，，只有小部分依靠線粒體功能穩(wěn)態(tài)對于維持心肌能量代謝具有重要意義[38]。在體通過脂肪酸氧化產(chǎn)生的 ATP 足以滿足機體化學能量動態(tài)需處于心肌肥大狀態(tài)時，其能量產(chǎn)生模式會由脂肪酸 β 氧化轉(zhuǎn)變臟供能不足，最終導致心肌肥大[39, 40]。同時，參與脂肪酸代謝
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

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本文編號：2681434