【摘要】：低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)常見于多種慢性呼吸系統(tǒng)疾病和慢性高原病。它是肺動脈高壓(Pulmonary hypertension,PH)中較常見一種類型,以肺血管重構(gòu)及收縮為特征性病理改變。肺血管收縮引起肺動脈壓升高,長期肺動脈壓升高導致肺血管重構(gòu),加重肺動脈高壓,最后誘發(fā)右心衰竭。以往大量研究證實,肺動脈高壓形成是由多因素引起,如血管內(nèi)活性物質(zhì)、血管內(nèi)皮細胞、血管壁外膜成纖維細胞等參與肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)收縮、增殖和凋亡,然而甚少關注肺泡上皮細胞對HPH的影響。肺泡作為氣體交換的首要場所,肺泡上皮細胞(AEC)是呼吸膜的組成部分,是最早感知肺泡內(nèi)氧分壓變化的細胞。文獻報道,只有在肺泡缺氧才能引起HPH,其它類型缺氧如循環(huán)型、血液型和組織型缺氧并不引起PH,而且肺泡低氧時只有肺部動脈壁(包括支氣管動脈)發(fā)生重構(gòu),外周體循環(huán)動脈壁不發(fā)生明顯的重構(gòu)�；谏厦娴睦碚�,我們認為,低氧信號始動的傳遞方向應該是從AEC到肺間質(zhì)微環(huán)境,再穿過肺血管壁傳向血液。其次,健康狀態(tài)下肺泡氧分壓是105mmHg,在5000~6000m的海拔高度肺泡氧分壓在45mmHg~40mmHg,因此AEC遭受到的氧分壓變化是60mmHg~65mmHg,而動脈內(nèi)皮細胞健康狀態(tài)時接觸的是靜脈血,混合靜脈血的氧分壓是40mmHg,即使在低氧狀態(tài)下,靜脈血氧分壓也不會低于20mmHg,所以肺血管內(nèi)皮不如AEC遭受的氧分壓變化劇烈。因此AEC是最早感知氧分壓變化和遭受氧分壓變化最劇烈的細胞,同時也是最早改變肺部微環(huán)境的細胞。另外,我們的研究結(jié)果表明,低氧肺動脈高壓模型大鼠肺動脈壓升高,主動脈壓(體循環(huán)壓)不發(fā)生明顯的改變,處于肺微環(huán)境中的肺小動脈和屬于體循環(huán)的支氣管動脈發(fā)生結(jié)構(gòu)重建,而屬于體循環(huán)不在肺微環(huán)境的腎動脈不發(fā)生重建;給予肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)和體循環(huán)血管主動脈平滑肌細胞(AASMCs)不同氧濃度(5%O_2、10%O_2、21%O_2)處理,PASMCs發(fā)生明顯增殖,而AASMCs增殖不明顯,說明單純低氧不足以引起體循環(huán)血管結(jié)構(gòu)重建,肺部微環(huán)境在血管的重構(gòu)和收縮中也發(fā)揮了一定的作用。因此我們提出肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的“微環(huán)境說”,即肺血管周圍的pH值、滲透壓、氧濃度、分泌物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的變化都會直接影響血管的結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)文獻和我們實驗結(jié)果,認為ROS是造成肺微環(huán)境改變的主要因素之一,而在低氧情況下引起肺微環(huán)境變化的最早的根源是AEC。因此,本實驗復制低氧條件AEC與PASMCs共培養(yǎng)細胞模型以及低氧肺泡上皮細胞培養(yǎng)上清液對離體肺血管影響模型,從AEC的角度,改變肺血管或PASMCs微環(huán)境,以ROS中H_2O_2為切入點,研究肺泡上皮細胞在HPH發(fā)生發(fā)展中的作用,從整體、離體血管和細胞水平探討AEC對肺血管張力和肺動脈壁重建的影響及其機制,為HPH的發(fā)病機制提供新的理論基礎,為防治HPH提供新的靶點。【研究目的】1、明確肺泡上皮細胞在HPH中肺血管重構(gòu)和肺血管收縮中的作用。2、以ROS中H_2O_2為切入點,深入地探討肺泡上皮細胞在低氧性肺血管重構(gòu)和肺血管收縮中作用機制。【研究方法】一、動物實驗1、成年雄性SD大鼠隨機分為:常氧組(normoxia,N)、低氧組(hypoxia,H),常氧組大鼠,在常氧條件下(21%O_2)飼養(yǎng)4周;低氧組大鼠,每天在低壓低氧艙內(nèi)(10%O_2)暴露8 h,連續(xù)低氧4周。一個月后,分別檢測各組大鼠右室收縮壓(right ventricle systolic pressure,RVSP)、主動脈壓(mCAP)、右室肥厚指數(shù)[RV/(LV+Sep)]、肺小動脈、支氣管動脈和腎動脈的中膜厚度百分比(medial thickness%,MT%)及面積百分比(medial area%,MA%)等,觀察其在常氧和低氧條件下變化的差異。二、細胞實驗1、原代培養(yǎng)ATII、PASMCs和AASMCs,利用透射電鏡,免疫細胞化學染色和免疫熒光對原代培養(yǎng)的ATII、PASMCs和AASMCs進行鑒定,同時購買大鼠肺泡上皮細胞系RLE-6TN。2、取3-5代對數(shù)生長期的原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs在不同氧濃度條件下(21%O_2、10%O_2、5%O_2)干預48 h,MTT和細胞計數(shù)法觀察不同氧濃度對PASMCs和AASMCs增殖的影響。3、利用Transwell將原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng)48 h,MTT法觀察不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)條件下肺泡上皮細胞對PASMCs和AASMCs增殖的影響。4、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清液,MTT法觀察肺泡上皮細胞條件培養(yǎng)上清液作用于PASMCs和AASMCs 48 h對其增殖影響。5、收集不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)48h原代ATII細胞,委托北京源宜基因科技有限責任公司進行基因檢測,同時進行QT-PCR檢測驗證差異基因的表達情況。6、根據(jù)基因檢測的結(jié)果,利用商業(yè)試劑盒對原代ATII細胞中的SOD活力和含量及H_2O_2進行檢測,利用流式細胞術對原代ATII細胞中總的ROS進行檢測,利用商業(yè)試劑盒對原代ATII細胞及其培養(yǎng)液中H_2O_2進行檢測。7、利用不同濃度(0μM、5μM、10μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2,48h后觀察對PASMCs和AASMCs增殖影響。選擇對PASMCs和AASMCs增殖影響最明顯H_2O_2濃度,觀察不同濃度ROS清除劑NAC(5mM、10mM)對H_2O_2誘導PASMCs和AASMCs增殖影響。8、利用Transwell將原代培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng),加入10mM NAC后,48h后觀察PASMCs和AASMCs增殖的變化。三、離體肺血管實驗1、分離正常大鼠和HPH大鼠肺內(nèi)三級肺小動脈和主動脈,制備完整的肺小動脈(PA)環(huán)和主動脈(AA)環(huán)。用苯腎上腺素(PE)預收縮血管環(huán),檢測血管環(huán)活性。2、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清,觀察對正常大鼠及HPH大鼠離體PA和AA收縮的影響。3、利用不同濃度(5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM)外源性H_2O_2觀察對正常大鼠PA和AA收縮的影響。選擇對PA和AA收縮影響最明顯H_2O_2濃度,不同濃度ROS清除劑NAC(5mM、10mM)處理后,觀察PA和AA收縮變化。4、收集原代培養(yǎng)ATII和RLE-6TN不同氧濃度(21%O_2、5%O_2)培養(yǎng)上清,加入10 mM NAC后,觀察對PA和AA收縮的影響�！狙芯拷Y(jié)果】1、HPH組大鼠RVSP、RV/(LV+S)%以及肺小動脈的MT%和MA%明顯高于正常大鼠組,而兩組大鼠mCAP卻差異不明顯;HPH大鼠組屬于體循環(huán)支氣管動脈MT%和MA%明顯高于正常大鼠組,而兩組大鼠屬于體循環(huán)的腎血管MT%和MA%差異不明顯;同時發(fā)現(xiàn)PASMCs隨低氧程度增加增殖越明顯,而AASMCs增殖的變化不明顯。本實驗提示PA和AA對低氧反應差異除了和低氧有關系外,可能和其所處的微環(huán)境有關系。2、PASMCs和AASMCs分別與ATII和RLE-6TN共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)常氧條件下,ATII沒有明顯促進PASMCs和AASMCs增殖,RLE-6TN抑制PASMCs和AASMCs增殖;低氧條件下,ATII和RLE-6TN均明顯促進了PASMCs和AASMCs增殖。3、ATII常氧培養(yǎng)上清液對常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖影響不明顯;RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清液抑制常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖。ATII和RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清對低氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖影響不明顯;ATII和RLE-6TN低氧培養(yǎng)上清液既能促進常氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖,也能促進低氧條件下培養(yǎng)的PASMCs和AASMCs增殖。4、ATII和RLE-6TN常氧培養(yǎng)上清液對常氧和HPH大鼠離體PA和AA收縮的影響不明顯,ATII和RLE-6TN低氧培養(yǎng)上清液促進常氧和HPH大鼠離體PA和AA收縮。5、ATII不同氧濃度下培養(yǎng)48h測序結(jié)果及QT-PCR結(jié)果顯示,與常氧組比,低氧促進肺泡上皮細胞SOD_2表達,對CAT表達影響不明顯;商業(yè)試劑盒及流式細胞術檢測結(jié)果顯示,低氧ATII內(nèi)總SOD含量和活力、總ROS及H_2O_2含量是增加的,ATII培養(yǎng)液中H_2O_2含量也是增加的。6、觀察不同劑量外源性H_2O_2對PASMCs和AASMCs增殖情況,MTT結(jié)果顯示,0μM到50μM H_2O_2促PASMCs增殖,呈現(xiàn)劑量依賴性,而100μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制PASMCs增殖。0μM到100μM H_2O_2促進AASMCs增殖,呈現(xiàn)劑量依賴性,而200μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制AASMCs增殖。其中50μM H_2O_2促PASMCs增殖最明顯,100μM H_2O_2促AASMCs增殖最明顯。在此濃度條件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2誘導PASMCs和AASMCs增殖,10 mM NAC作用更明顯。7、觀察不同劑量外源性H_2O_2對PA和AA收縮情況,血管環(huán)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),5μM到400μM H_2O_2隨著劑量增加,促進PA收縮;從600μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制PA收縮。5μM到600μM H_2O_2隨著劑量增加,促進AA收縮;從800μM到1000μM H_2O_2隨著劑量增加,逐漸抑制AA收縮。其中400μM H_2O_2促PA收縮最明顯,600μM H_2O_2促AA收縮最明顯。在此濃度條件下,加入5 mM和10 mM NAC都能有效抑制H_2O_2誘導PA和AA收縮,10 mM NAC作用更明顯。8、ATII培養(yǎng)液中H_2O_2含量在促進PASMCs和AASMCs增殖范圍內(nèi),也在促進PA和AA收縮范圍內(nèi)。選擇10 mM NAC,加到PASMCs和AASMCs與ATII和RLE-6TN低氧共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中,明顯抑制PASMCs和AASMCs增殖。選擇10 mM NAC,加入到含有低氧ATII和RLE-6TN培養(yǎng)上清液浴槽中,明顯抑制PA和AA收縮。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1

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