【摘要】：目的:本研究將分泌型Klotho(sKL)轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)內(nèi),通過靜脈注射的方式將sKL修飾的BMSCs移植至已構(gòu)建的腹主動(dòng)脈瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)大鼠模型中。通過細(xì)胞培養(yǎng)、病毒制備、組織形態(tài)學(xué)和Western Blot等實(shí)驗(yàn)方法,觀察腹主動(dòng)脈管壁的變化及與衰老、炎癥、氧化應(yīng)激等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,以探討分泌型sKL修飾的BMSCs在AAA修復(fù)中可能發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制,為AAA的治療提供新的思路。方法:1、體外條件下培養(yǎng)大鼠BMSCs,將其分為3組:N組、GFP組、sKL組。N組作為正常對(duì)照組,不作任何處理。GFP組、sKL組分別感染GFP空載重組慢病毒、攜帶Klotho基因的慢病毒表達(dá)載體,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察感染效率,蛋白免疫印跡法(Western Blot)技術(shù)分別對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中sKL、P21與P53以及培養(yǎng)基中sKL進(jìn)行定量分析。2、將Wistar大鼠隨機(jī)分為五組:N組、AAA組、MSC組、GFP組、sKL組。N組作為正常對(duì)照組,不作任何處理;其余4組進(jìn)行AAA模型制作,其中AAA組作為AAA實(shí)驗(yàn)組,模型制作完成后不作處理,MSC組、GFP組、sKL組在完成AAA模型后即尾靜脈分別注射BMSCs、攜帶GFP的BMSCs、sKL過表達(dá)的BMSCs,每周注射一次(1x10~6個(gè)),四周后取血液和腹主動(dòng)脈,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。3、測(cè)量動(dòng)脈管徑,檢測(cè)過表達(dá)sKL的BMSCs是否浸潤動(dòng)脈病灶區(qū)域;通過HE染色、地衣紅染色和Masson染色分別觀察動(dòng)脈管壁的總體變化、彈力板與膠原纖維的形態(tài)。通過β-Gal染色對(duì)衰老細(xì)胞進(jìn)行了定位和半定量分析,通過免疫組化技術(shù)分別對(duì)各組動(dòng)脈組織中SIRT1、CD45、CD68、α-SMA進(jìn)行定位和半定量分析,Western Blot技術(shù)對(duì)血清中sKL以及各組動(dòng)脈組織中SIRT1、P21、P53、NF-κB、P-AMPKα、AMPKα、MMP-2、MMP-9進(jìn)行定量分析。結(jié)果:1、熒光顯微鏡鏡下觀察BMSCs感染效率,Western Blot檢測(cè)BMSCs及其培養(yǎng)基中sKL的含量,其中sKL組相較于N組和GFP組顯著增高。MTT結(jié)果表明sKL對(duì)BMSCs的增殖無顯著影響。Western blot檢測(cè)BMSCs中衰老標(biāo)志物P53、P21。結(jié)果表明,sKL可下調(diào)BMSCs中P53、P21的表達(dá)。2、AAA模型4周后取材,直徑測(cè)量結(jié)果可知,AAA組相較于N組明顯擴(kuò)張,且呈現(xiàn)明顯的鈣化,MSC組、GFP組以及sKL組相對(duì)AAA組明顯減輕,sKL組達(dá)到最佳的治療效果。HE染色觀察腹主動(dòng)脈管壁的形態(tài),由結(jié)果可知AAA組較N組動(dòng)脈管徑增大,伴管壁變薄、破裂,治療組相對(duì)于AAA組有很大的改善,其中sKL組效果最佳。地衣紅染色表明,AAA組彈力板斷裂明顯,sKL組可顯著抑制動(dòng)脈管壁彈力板的斷裂。Masson染色結(jié)果可知,AAA組動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞明顯減少,中膜處膠原纖維明顯增多,sKL組與AAA組相比,平滑肌細(xì)胞明顯增多。3、Western Blot檢測(cè)大鼠血清中sKL水平,AAA組中sKL含量相較于N組明顯降低,治療組相對(duì)AAA組明顯升高。4、SIRT1免疫組化及Western Blot結(jié)果表明,其主要定位于血管中膜平滑肌細(xì)胞,在AAA組中,SIRT1明顯下降,治療組與AAA組相比SIRT1含量上升,其中sKL組顯著上升。5、β-Gal衰老細(xì)胞染色結(jié)果可知,AAA組有大量衰老細(xì)胞,治療組衰老細(xì)胞明顯減少,sKL組可顯著降低細(xì)胞衰老。α-SMA免疫熒光結(jié)果可知,N組平滑肌細(xì)胞數(shù)量很多,AAA組明顯減少,MSC組及GFP組可看出平滑肌細(xì)胞數(shù)量較AAA組增加,sKL組接近于正常水平。Western Blot檢測(cè)AAA組織中P53、P21的表達(dá),結(jié)果顯示,AAA組中P53、P21高表達(dá),治療組中逐漸下降,sKL組明顯下降。6、免疫組化檢測(cè)AAA組織中炎癥細(xì)胞CD45、CD68的表達(dá),結(jié)果表明陽性細(xì)胞主要定位于動(dòng)脈壁外膜,AAA組中有大量炎癥細(xì)胞浸潤,治療后浸潤炎癥細(xì)胞減少,其中sKL組最少。Western Blot結(jié)果顯示,NF-κB在N組中少量表達(dá),而在AAA組高表達(dá),治療組水平降低,而在sKL組中下調(diào)最為明顯。7、DHE檢測(cè)活性氧含量發(fā)現(xiàn),AAA組中有大量的活性氧,治療組逐漸下降,sKL組接近于正常水平。Western Blot檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白P-AMPKα及AMPKα在動(dòng)脈中表達(dá),結(jié)果顯示,AAA組P-AMPKα水平低于N組,治療組含量相對(duì)上升,sKL組中明顯上升。8、Western Blot證實(shí),AAA組中MMP-2和MMP-9表達(dá)上調(diào),治療組均下降,sKL組較為顯著。結(jié)論:過表達(dá)sKL的BMSCs具有抑制AAA病理性擴(kuò)張的作用,其作用可能是通過抑制動(dòng)脈管壁細(xì)胞衰老、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 Klotho 對(duì) BMSCs 增殖的影響3.1.1 過表達(dá) Klotho 的 BMSCs 構(gòu)建Klotho 是一種衰老抑制基因，在衰老相關(guān)疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。我們將 Klotho 穩(wěn)轉(zhuǎn)至 BMSCs，以此來探究 sKL 對(duì) BMSCs 的影響。熒光倒置顯微鏡鏡下觀察各組細(xì)胞可見，GFP 組和 sKL 組中有大量綠色熒光，N 組未見熒光，表明包裝 Klotho 慢病毒已成功感染至 BMSCs（圖 1）。N GFP sKL

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文腹主動(dòng)脈 HE 染色結(jié)果可見，N 組動(dòng)脈壁排列規(guī)則；AAA 組藍(lán)色病變部位表明大量鈣沉積，同時(shí)管壁變薄、中膜破裂、管徑較正常組明顯擴(kuò)張；MSC 組和 GFP 組同 AAA 組相比中膜破損情況得到明顯改善；sKL 組腹主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)已接近正常 N 組，，管徑略微擴(kuò)張（圖 6、圖 7）。N AAA MSC
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R543.1

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本文編號(hào)：2677997