【摘要】：線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場所,而線粒體呼吸電子傳遞鏈在線粒體的能量代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,線粒體電子傳遞障礙將影響線粒體呼吸的氧化磷酸化過程和能量代謝,從而產(chǎn)生一系列的線粒體相關(guān)疾病。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)作為母系遺傳的主要遺傳物質(zhì),與核基因一同對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控,mtDNA多態(tài)性包括mtDNA的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)、單倍型、單倍群以及拷貝數(shù)變異(copy number variant,CNV)多種遺傳變異。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA多態(tài)性與高原適應(yīng)以及多種高原疾病都存在相關(guān)性。高原地區(qū)環(huán)境以低溫低氧為主要特征,世居高原的人群往往對高原環(huán)境有了一定的適應(yīng),而適應(yīng)不良的人群,易發(fā)生高原疾病。線粒體作為細(xì)胞能量代謝和缺氧適應(yīng)的主要結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)和功能的改變對高原適應(yīng)及高原疾病的發(fā)生有重要的影響[1]。中國塔吉克族主要分布在帕米爾高原東部的新疆喀什地區(qū)的塔什庫爾干縣[2],世居高原已經(jīng)數(shù)千年,總?cè)藬?shù)只有五萬余人,在中國塔吉克族五十歲以上人群的高血壓患病率調(diào)查中發(fā)現(xiàn),其高血壓患病率為39.2%,其對塔吉克族人群的健康產(chǎn)生著嚴(yán)重危害,目前對其機(jī)制研究缺乏[3-5]。本課題通過核基因和線粒體基因組測序,可以對中國塔吉克族的遺傳特點(diǎn)和高原遺傳適應(yīng)有一個更加深刻的認(rèn)識,從而為其高原疾病防治提供相應(yīng)的指導(dǎo)和幫助。研究表明,mtDNA多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)病密切相關(guān)[6-8],例如mt15927G→A和mt7492C→T突變是原發(fā)性高血壓的致病突變,mtDNA的16189T→C突變與9-BP(CCCCCTCTA)缺失,以及mt4401G和mt5821A的單倍型組合與家系研究中的原發(fā)性高血壓相關(guān),線粒體t RNA Ile的mt4263A→G突變與母系遺傳性高血壓也是存在相關(guān)的。但是mtDNA多態(tài)性和高原原發(fā)性高血壓(high altitude essential hypertension,HAEH)易感性相關(guān)的研究還沒有報道。高原低氧環(huán)境對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能都有著很大影響,mtDNA多態(tài)性與HAEH的相關(guān)性研究,可以揭示其遺傳易感因素,還能尋找其相關(guān)分子機(jī)制。本文從mtDNA角度對中國塔吉克族人群的HAEH遺傳易感因素進(jìn)行了分析,并尋找其背后的遺傳分子機(jī)制。研究方法:第一部分:1.在中國新疆喀什地區(qū)塔什庫爾干縣,采集中國塔吉克族HAEH全血標(biāo)本53例,血壓正常的對照組全血標(biāo)本46例,并收集相關(guān)臨床基本信息,標(biāo)本經(jīng)EDTA抗凝低溫保存運(yùn)送至陸軍軍醫(yī)大學(xué),提取全血DNA后進(jìn)行相關(guān)遺傳學(xué)研究。2.挑選1例健康成年男性,編號為T153,對其全血DNA標(biāo)本采用高通量二代測序技術(shù),對其核基因組數(shù)據(jù)的各類變異進(jìn)行分析,篩選出與高原適應(yīng)相關(guān)的單核苷酸變異(single nucleotide variant,SNV)、CNV。第二部分:1.設(shè)計擴(kuò)增和測序引物,然后對53例HAEH組和46例對照組的DNA標(biāo)本進(jìn)行線粒體基因組的PCR擴(kuò)增和測序。2.對標(biāo)本進(jìn)行篩選,將HAEH組53例樣本和對照組46例樣本的線粒體基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,尋找存在統(tǒng)計學(xué)差異的mtDNA單倍群和SNP位點(diǎn),找到與HAEH相關(guān)的遺傳易感因素。第三部分:通過生物信息學(xué)軟件來分析預(yù)測MTCYB(mitochondrial cytochrome B,線粒體細(xì)胞色素B)蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu),尋找MTCYB的M316T突變與HAEH易感性相關(guān)的分子基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第一部分:T153全基因組測序結(jié)果顯示,在高原適應(yīng)相關(guān)的SNV、CNV方面,T153的高原適應(yīng)相關(guān)基因SNV分布與藏族、埃塞俄比亞和安第斯山脈人群不同,表明其可能存在其它高原遺傳適應(yīng)機(jī)制,而T153基因DAZ的CNV均表現(xiàn)為減少,可能是中國塔吉克族男性人群性激素水平較低的影響因素。第二部分:在中國塔吉克族人群中發(fā)現(xiàn),mtDNA單倍群亞群U4b是HAEH的易感因素,而mtDNA的SNP位點(diǎn)15693的T→C突變,導(dǎo)致MTCYB的316氨基酸由甲硫氨酸(Met)→蘇氨酸(Thr)的錯義突變,從而影響線粒體結(jié)構(gòu)及其功能,可能是其主要的分子機(jī)制。第三部分:M316T突變會導(dǎo)致MTCYB一個新的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)出現(xiàn),使得相應(yīng)的磷酸化反應(yīng)Vmax值和Km值都增加,這可能是M316T突變導(dǎo)致MTCYB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能變化,進(jìn)而引起線粒體呼吸電子傳遞鏈功能障礙的一個重要因素,這可能是MTCYB(M316T)導(dǎo)致中國塔吉克族HAEH易感的分子機(jī)制。結(jié)論:1.中國塔吉克族T153的高原遺傳適應(yīng)機(jī)制與藏族、埃塞俄比亞人群以及安第斯山脈人群不同,可能存在其它機(jī)制,其DAZ基因拷貝數(shù)降低可能是中國塔吉克族男性激素水平較低的影響因素;2.mtDNA單倍群亞群U4b是中國塔吉克族HAEH的遺傳易感因素;3.mt15693T→C突變引起MTCYB的316M→T突變,導(dǎo)致MTCYB蛋白質(zhì)出現(xiàn)了一個新的磷酸化結(jié)合位點(diǎn),從而影響線粒體復(fù)合體Ⅲ的結(jié)構(gòu)功能,導(dǎo)致線粒體能量代謝異常,這一系列的分子結(jié)構(gòu)功能改變,我們推測其可能是HAEH遺傳易感的一個分子機(jī)制。
【圖文】：

15圖 2.1 實(shí)驗(yàn)室建庫和質(zhì)控流程圖息學(xué)分析38 參考基因組比對得到的結(jié)果進(jìn)行分類和注釋，利以及小的插入缺失（Small InDel）進(jìn)行注釋，利用軟CNV）檢測后進(jìn)行相應(yīng)信息注釋，最后將所有檢測行全局統(tǒng)覽。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文16圖 2.2 生物信息學(xué)分析流程圖2.2.2 T153 的高原適應(yīng)性分析（1）SNV 致病性預(yù)測SIFT[25]和 PolyPhen2_HDIV[26]是目前比較具代表性的突變有害性預(yù)測軟件（算法），根據(jù)氨基酸發(fā)生取代的情況（如氨基酸酸堿性、對空間結(jié)構(gòu)可能造成的影響等）進(jìn)行打分，PolyPhen2_HDIV score 的打分方式下，值大于 0.453 為有害突變；SIFT score 打分方式下，值小于 0.05 為有害性突變。對 T153 檢測到的錯義突變利用上述兩種方法進(jìn)行預(yù)測，找到與 T153 高原遺傳適應(yīng)和高原疾病遺傳易感的相關(guān)位點(diǎn)。（2）SNV 高原適應(yīng)性分布世界上有三大高原適應(yīng)人群[27, 28]，，包括青藏高原藏族、南美安第斯山印第安人以及東非的埃塞俄比亞人，其中藏族高原適應(yīng)最好，將這些人群中的常見高原適應(yīng)相關(guān)的 SNV，在中國塔吉克族 T153 核基因的全基因組測序數(shù)據(jù)注釋列表中進(jìn)行檢索，并
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R544.1

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本文編號：2677762