【摘要】：背景:肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)是最常見的遺傳性心肌病之一,也是造成年輕人和運(yùn)動員猝死最常見的原因之一。該病在解剖學(xué)、病理生理學(xué)、分子生物學(xué)和臨床表型等特征上具有高度的異質(zhì)性。該疾病主要的致病基因是編碼肌小節(jié)蛋白的8個關(guān)鍵基因,其中編碼肌球蛋白重鏈(MYH7)和肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3)的基因影響范圍最廣。既往研究表明,基因型與HCM患者的特定表型相關(guān),但仍不確定其與組織病理學(xué)改變之間是否存在關(guān)聯(lián);且HCM致病機(jī)制的相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)很大程度上仍然未知。本文的主要目的就是全面研究基因型對臨床表型、病理改變以及疾病轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響。方法:本研究主要對193例基于基因組合(panel)測序及173例基于全外顯子組測序(WES)的肥厚梗阻型心肌病(HOCM)患者樣本進(jìn)行分析,并根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會的指南(ACMG)將所有罕見變異位點(diǎn)的致病性分為6類,致病(P)、可能致病(LP)、臨床意義不明(VUS)、可能良性和良性以及VUS-LP(表示僅缺少一條支持性證據(jù)就可升級為可能致病的變異位點(diǎn));并對基因型與HOCM臨床表型、以及病理學(xué)改變之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了深入的研究。對未成年患者進(jìn)行單獨(dú)的檢測分析。此外,選取30名不同基因型(MYBPC3組、MYH7組和無變異組)的HOCM患者室間隔切除術(shù)后的得到的左心室心肌組織,并與9名健康供體的做對照,從組織中提取RNA進(jìn)行的RNA測序(RNAseq),并通過多種生物信息學(xué)的方法分析比較各組間差異性表達(dá)的基因、lncRNA及其附近共表達(dá)的基因,根據(jù)信號通路和分子功能進(jìn)行聚類分析,尋找HOCM潛在的致病機(jī)制;并對預(yù)測的異常轉(zhuǎn)錄本(剪接事件)進(jìn)行驗證。最后對特殊病例進(jìn)行了分析總結(jié)。結(jié)果:在366名HOCM患者中共檢出11個基因上的365個罕見變異位點(diǎn),其中LP/P變異占50.5%,而未成年患者(年齡≤18歲)中攜帶VUS-LP或者LP/P的比例高達(dá)76.5%,僅有12.8%的患者不攜帶任何可疑的變異位點(diǎn)。攜帶變異位點(diǎn)的患者,不論是VUS還是LP/P,診斷年齡都比不攜帶任何變異位點(diǎn)的患者要小(P0.0001);LP/P組的左心室的后壁較薄(P=0.0009),而室間隔的最后出要明顯比無變異組厚(P=0.0025),但VUS組與無變異組無統(tǒng)計學(xué)差異;同時LP/P組更有可能有家族史(P=0.0008)。與沒有任何變異的患者相比,攜帶LP/P變異的患者在細(xì)胞肥大(P=0.026),心肌細(xì)胞紊亂(P=0.006)和間質(zhì)纖維化(P=0.036)方面顯著增加,而攜帶VUS的患者沒有明顯的差異。另外,與對照組相比,在HOCM患者的心肌組織中共鑒定出373個差異性表達(dá)的編碼基因(DECG)和150個差異性表達(dá)的lncRNA基因(DELG)。這些DEG的表達(dá)水平的變異性可以在具有不同變異位點(diǎn)(MYBPC3,MYH7或無變異)的HOCM患者中觀察到,并且在各組之間沒有差異,但可以與對照組明顯分成兩部分。在DNA測序的數(shù)據(jù)中通過計算機(jī)工具預(yù)測的7個剪接變異在心臟組織的RNA水平上得到驗證,6個被證實導(dǎo)致異常剪接的發(fā)生。另外通過RNAseq數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)了 3個心肌病相關(guān)基因中的剪接事件。并對3例WES鑒定到致病變異的家系進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)論:本文首次通過大規(guī)模的組織切片綜合檢查和Panel基因篩查,揭示了基因型的對患者臨床特征的影響,包括變異位點(diǎn)的數(shù)量和致病性,以及對組織病理學(xué)和某些表型改變的影響。這種方法不僅填補(bǔ)了HCM患者基因型和組織病理學(xué)改變之間的關(guān)聯(lián),而且還有可能有助于預(yù)測臨床結(jié)果。心肌組織的RNAseq結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常的心肌組織相比,HOCM患者心肌的轉(zhuǎn)錄組水平存在顯著差異。該論文表明基因測序在HOCM患者的臨床管理中具有重要的意義,與RNAseq數(shù)據(jù)聯(lián)合應(yīng)用會有更好的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

圖１邋ＲＮＡｓｅｑ實驗和數(shù)據(jù)分析流程圖逡逑６ＲＮＡ文庫構(gòu)建和測序逡逑６．１試劑：逡逑Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ邋Ｒｉｂｏ－ｚｅｒｏ邋ｒＲＮＡ邋去除試劑盒，Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ，美國逡逑ＮＥＢＮｅｘｔ用于美國內(nèi)布拉斯加州Ｉｌｌｕｍｉｎａ的超定向ＲＮＡ文庫制備試劑盒逡逑ＲＮＡ邋Ｎａｎｏ邋６０００檢測試劑盒，安捷倫科技，美國逡逑ｑｕｂｉｔ邋ｍａ檢測試劑盒，熱力科學(xué)，美國逡逑ｈｉｓｅｑ邋４０００邋ｐｅ邋集群套件，ｉｌｌｕｍｉｎａ，美國逡逑６．２設(shè)備：逡逑ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ邋分光光度計（ＩＭＰＬＥＮ，ＣＡ，美國）逡逑Ａｇｉｌｅｎｔ邋Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ邋２１００邋系統(tǒng)（Ａｇｉｌｅｎｔ邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，美國）逡逑Ｑｕｂｉｔ邋焚光計（Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美國）逡逑

異（３１．８％）被歸類為ＬＰ／Ｐ，在１８５例ＨＯＣＭ患者中出現(xiàn)（陽性率為５０．５％）；這逡逑些變異位點(diǎn)主要位于（８１名患者中發(fā)現(xiàn)４５個致病位點(diǎn)，３９．１％）和ＭＦ５ＰＣ３逡逑（８０名患者中發(fā)現(xiàn)５４個致病位點(diǎn)，４７．０％）（詳見圖１）。值得注意的是，，在ＨＣＭ逡逑擬表型綜合征疾病的相關(guān)基因（兄４／７中４個，ＺＪＭＰ２中１個、７７７？中１個和中逡逑１個）中鑒定出７個致病位點(diǎn)，并且其中有兩個是與肌節(jié)變異同時存在的。１２３例ＨＯＣＭ逡逑患者的檢測結(jié)果為陰性，即在８個關(guān)鍵肌小節(jié)基因及３個擬表型的基因中均未檢測到逡逑ＶＵＳ級別以上（含ＶＵＳ）變異；其中１７名患者攜帶多個變異位點(diǎn)。致病位點(diǎn)的詳細(xì)逡逑信息和出現(xiàn)次數(shù)詳見附錄二中的表１．附錄二中表２列出了參與病理分析的１９３名逡逑Ｐａｎｅｌ測序的ＨＯＣＭ患者的詳細(xì)臨床信息和基因型結(jié)果，部分家庭成員的級聯(lián)篩查結(jié)逡逑果如圖２所示。逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R542.2

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本文編號：2673877