【摘要】：背景和目的:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)引起的急性心血管疾病事件已成為人類的頭號(hào)殺手。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種獲得性免疫細(xì)胞,在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要的調(diào)控作用。從以往的研究中可以看出,Treg在血管免疫穩(wěn)態(tài)的維持和抑制AS發(fā)生發(fā)展中其重要作用。固有淋巴細(xì)胞(ILCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型天然免疫細(xì)胞,在免疫反應(yīng)和組織構(gòu)建和修復(fù)中均發(fā)揮著重要作用。根據(jù)最新研究表明ILC2s可能減緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。但Treg是否通過調(diào)控ILC2s活化進(jìn)而抑制AS目前國內(nèi)外均無研究。所以,在本研究中,我們旨在研究Treg在動(dòng)脈粥樣硬化病理過程中的作用機(jī)制,其是否通過活化ILC2s改善動(dòng)脈粥樣硬化疾病。方法:1.ApoE-/-小鼠高脂飲食16周同時(shí)過繼轉(zhuǎn)輸Tregs,通過油紅O染色主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部,組化染色Masson,CD68,α-SMA主動(dòng)脈根部,研究Treg對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。2.分選CD4~+Foxp3(GFP)~+Treg細(xì)胞和ILC2s細(xì)胞(Lin~-CD45~+ICOS~+CD127~+CD25~+),體外共培養(yǎng),通過ELISA檢測ILC2s分泌IL-5,IL-13量,體外研究Treg對(duì)ILC2s影響。3.ApoE-/-小鼠高脂飲食16周同時(shí)過繼轉(zhuǎn)輸Tregs,通過流式分析檢測脾臟,骨髓和PaLN中ILC2s比例和數(shù)量,體內(nèi)研究Treg對(duì)ILC2s的影響。4.向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射anti-CD90.2,IL-2/Jes6-1,PBS同時(shí)高脂飲食16周,流式分析檢測脾臟中ILC2s比例,驗(yàn)證敲除和擴(kuò)增ILC2s;油紅O染色主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部,組化染色Masson,CD68,α-SMA主動(dòng)脈根部,研究ILC2s對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。5.ApoE-/-Rag1-/-小鼠高脂飲食16周過繼轉(zhuǎn)輸Tregs,流式分析檢測脾臟和骨髓中ILC2s比例和數(shù)量,研究Treg對(duì)ILC2s的影響;ApoE-/-Rag1-/-小鼠高脂飲食16周同時(shí)過繼轉(zhuǎn)輸Treg細(xì)胞或過繼轉(zhuǎn)輸Treg同時(shí)腹腔注射anti-CD90.2,油紅O染色主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部,組化染色Masson,CD68,α-SMA主動(dòng)脈根部,,研究Treg通過ILC2s進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。6.CD4~+Foxp3~+Treg細(xì)胞和ILC2s共培養(yǎng)時(shí)加入anti-IL-10和或anti-TGF-Β抗體;CD4~+Foxp3~+Treg細(xì)胞和ILC2s進(jìn)行transwell培養(yǎng);通過ELISA檢測ILC2s分泌IL-5,IL-13量,研究Treg活化ILC2s的作用機(jī)制。結(jié)果:1.ApoE-/-小鼠高脂飲食16周同時(shí)過繼轉(zhuǎn)輸Treg,油紅染色主動(dòng)脈斑塊面積減少,主動(dòng)脈竇斑塊面積減少,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,膠原升高,而平滑肌無變化。2.通過ELISA檢測ILC2s分泌IL-5,IL-13量,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明Treg能促進(jìn)ILC2s分泌IL-5,IL-13。3.ApoE-/-小鼠高脂飲食16周同時(shí)過繼轉(zhuǎn)輸Tregs,Treg能夠升高ILC2s比例和細(xì)胞數(shù)量。4.向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射IL-2/Jes6-1,油紅染色主動(dòng)脈斑塊面積減少,主動(dòng)脈竇斑塊面積減少,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,膠原升高,而和平滑肌無變化。向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射anti-CD90.2,油紅染色主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇斑塊面積,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量,膠原升高和平滑肌均無變化。5.ApoE-/-Rag1-/-小鼠過繼轉(zhuǎn)輸Treg同時(shí)高脂飲食16周,Treg能夠升高ILC2s比例和細(xì)胞數(shù)量;與PBS相比,在ApoE-/-Rag1-/-小鼠過繼轉(zhuǎn)輸Treg,整根主動(dòng)脈內(nèi)斑塊面積減少,主動(dòng)脈竇斑塊損傷下降,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞減少,膠原比例升高;與過繼轉(zhuǎn)輸Treg同時(shí)腹腔注射antiCD90.2相比,在ApoE-/-Rag1-/-小鼠過繼轉(zhuǎn)輸Treg,整根主動(dòng)脈內(nèi)斑塊面積減少,主動(dòng)脈竇斑塊損傷下降,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞減少,而膠原和平滑肌比例無變化。6.CD4~+Foxp3~+Treg細(xì)胞和ILC2s共培養(yǎng)時(shí)加入anti-IL-10和或anti-TGF-Β抗體,通過ELISA檢測細(xì)胞因子,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明Treg通過分泌IL-10和TGF-Β機(jī)制活化ILC2s,而CD4~+Foxp3~+Treg細(xì)胞和ILC2s進(jìn)行transwell培養(yǎng),表明Treg通過細(xì)胞接觸方式活化ILC2s。討論:通過以上研究,我們可以得到以下結(jié)論:1.Treg延緩動(dòng)脈粥樣硬化2.在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),CD4~+Foxp3~+Treg均能增加ILC2細(xì)胞數(shù)量和促進(jìn)分泌IL-13。3.ILC2s延緩動(dòng)脈粥樣硬化。4.Treg通過活化ILC2s進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化。5.CD4~+Foxp3~+Treg通過分泌IL-10,TGF-Β和細(xì)胞接觸方式活化ILC2s。
【圖文】：

活化和瑞氏姬姆薩染色 ILC2s在 C57BJL/6 小鼠脾臟中分選 ILC2（7-AAD-CD45+Lin-ICOS+CD127+CD25+）（圖2A）根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ILC2s 具有淋巴細(xì)胞特性即高核質(zhì)比[7 31 32]和 IL-33能夠活化 ILC2s[7 33-36]，，于是我們將分選得到 ILC2s 進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色和用 IL-2，IL-33 刺激，并用 ELISA 方法驗(yàn)證其活化。結(jié)果顯示：瑞氏吉姆薩染色分選后的 ILC2s,顯示具有細(xì)胞質(zhì)染色淺，細(xì)胞核染色深及高核質(zhì)比的淋巴細(xì)胞特性（圖 2B），ILC2s 受 IL-2 和 IL-33 刺激較 medium 培養(yǎng)其分泌IL-5 和 IL-13 量均（圖 2C 和 D）升高。表明 ILC2s 是一種淋巴細(xì)胞且 IL-13能夠活化 ILC2s。

24圖 3：在體外實(shí)驗(yàn)水平，Treg 具有擴(kuò)增 ILC2s 和促進(jìn) ILC2s 分泌細(xì)胞因子功能。A：從 8 周 Foxp3GFP雄鼠脾臟分選 CD4+Foxp3(GFP)+Treg 流式代表圖;B 分選后CD4+Foxp3(GFP)+Treg 純度流式代表圖; CD4+Foxp3+Treg（4×105細(xì)胞/孔）在 96孔 培 養(yǎng) 板 內(nèi) 不 受 (Rest Treg) 或 者 受 （ Activated Treg ）anti-CD3(5ug/ml),anti-CD28(2ug/ml)和 IL-2（200U/ml）刺激 3 天，C： ELISA分別檢測 Activated Treg 組（n=6）和 Rest Treg 組（n=6）的上清液中 IL-10,TGF-
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2670665