【摘要】：目的:研究miR-322在心肌細胞缺氧-復氧損傷中的作用及機制,本實驗以干細胞定向分化為心肌細胞,通過心肌細胞缺氧-復氧實驗模擬心肌梗死環(huán)境中發(fā)生的心肌缺血再灌注,希望通過此研究,為心肌損傷臨床防治提供新思路。方法:1、小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)與胚胎干細胞(mESC-D3)培養(yǎng)。2、慢病毒制備與轉(zhuǎn)染。構(gòu)建攜帶目的基因的慢病毒,miR-322過表達、miR-322敲減、Celf1過表達、Celf1敲減、miR-322與Celf1同時過表達,構(gòu)建后轉(zhuǎn)入mESC-D3細胞中,并篩選表達目的基因的細胞。3、mESC-D3細胞定向分化為心肌細胞。將胚胎干細胞分為8組:未缺氧復氧組(Normal);野生細胞缺氧復氧組(Wild);空病毒細胞缺氧復氧組(Empty);miR-322上調(diào)細胞缺氧復氧組(322-up);miR-322下調(diào)細胞缺氧復氧組(322-down);Celf1上調(diào)細胞缺氧復氧組(Celf1-LV);Celf1下調(diào)細胞缺氧復氧組(Celf1-RNAi);miR-322和Celf1同時上調(diào)缺氧復氧組(322-up+Celf1-LV)。經(jīng)由懸滴培養(yǎng)方法制成擬胚體,4.5d后收集擬胚體在6cm培養(yǎng)皿中。4、細胞缺氧復氧。分化建模成功,心肌細胞成熟時(選擇分化后第8天)進行缺氧復氧處理。缺氧:5%C0_2、95%N_2 3h,復氧:5%C0_2、95%O_2 2h。5、檢測指標。觀察各組細胞缺復氧后狀態(tài);熒光顯微鏡檢測各處理組心肌細胞自發(fā)搏動頻率變化;通過MTT比色法檢測缺復氧前后細胞存活率;檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性和細胞內(nèi)ATP含量變化;實時定量RT-PCR,以GAPDH作為標準對照,測定各組細胞相關(guān)心肌細胞基因(OCT-4,Nkx-2.5,α-MHC,MLC-2V,Sox-2)的變化;Western blot檢測各組細胞蛋白(Nkx-2.5、cTnT)的表達水平。6、統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析應用t檢驗評估兩組差異性,P0.05。結(jié)果:1、mESC-D3細胞成功誘導分化為可以產(chǎn)生自發(fā)搏動的心肌細胞;2、miR-322上調(diào)、Celf1下調(diào)對干細胞分化的心肌細胞H/R損傷具有保護作用。Wild組心肌細胞搏動頻率及存活率較Normal組明顯降低,細胞內(nèi)ATP含量降低,細胞培養(yǎng)液LDH活性升高,表明H/R造模成功。與對照組比較,322-up組、Celf1-RNAi組心肌細胞存活率、搏動頻率增加,細胞內(nèi)ATP含量升高,細胞培養(yǎng)液LDH活性降低,PCR結(jié)果表明多能性相關(guān)性基因(OCT-4、Sox-2)及心肌細胞基因(Nkx-2.5、MLC-2V、α-MHC)均上調(diào),WB結(jié)果表明心肌細胞蛋白Nkx-2.5、cTnT均上調(diào)。3、miR-322通過抑制Celf1表達來達到對干細胞分化的心肌細胞H/R損傷的保護作用。與對照組比較,322-up+Celf1-LV組心肌細胞存活率、搏動頻率增加,細胞內(nèi)ATP含量升高,細胞培養(yǎng)液LDH活性降低,但各指標變化均不如322-up組明顯。PCR結(jié)果表明OCT-4、Sox-2、Nkx-2.5、MLC-2V、α-MHC基因均上調(diào),WB結(jié)果表明心肌細胞蛋白Nkx-2.5、cTnT均上調(diào),miR-322通過調(diào)控Celf1表達,調(diào)控下游基因表達,進而調(diào)控蛋白表達,從而發(fā)揮保護心肌細胞的作用,但miR-322上調(diào)沒有完全抑制Celf上調(diào)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用,說明miR-322和Celf1中間還有復雜的機制、中間分子有待研究。結(jié)論:1、miR-322上調(diào)對缺氧復氧心肌損傷有保護作用;2、Celf1下調(diào)對缺氧復氧心肌損傷有保護作用;3、miR-322通過抑制Celf1表達來達到對缺氧復氧心肌損傷的保護作用;
【圖文】：

ES細胞分化為心肌細胞的實驗方法

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果3.1 細胞培養(yǎng)與分化3.1.1 Mef 細胞與 mESC-D3 細胞培養(yǎng)Mef 細胞呈梭形，胞質(zhì)有多個向外延伸的突起，，作為 ESC-D3 的飼養(yǎng)層細胞，為 mESC-D3 細胞提供附著、營養(yǎng)，并能抑制其分化；mESC-D3 細胞呈團生長，排列緊密，生長于飼養(yǎng)層之上，生長迅速，復蘇后第 2 天換液，第 4 天即可傳代（1:4-1:6）。（見圖 2）
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

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本文編號：2670349