【摘要】：目的制備間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的微顆粒(MSC-MPs),觀察其對(duì)ISO誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞肥大的影響,并初步分析其作用機(jī)制。方法全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs,通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記三方面對(duì)MSCs進(jìn)行綜合鑒定。用MPs-free培養(yǎng)基饑餓處理第5代MSCs 48h,收集細(xì)胞上清液,梯度離心獲得MSC-MPs。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSC-MPs表面陽(yáng)性標(biāo)志物CD29和CD90,以及陰性標(biāo)志物CD34和CD45的表達(dá)情況。BCA蛋白濃度試劑盒和流式檢測(cè)所獲得MSC-MPs的蛋白含量和數(shù)目。用5μmol·L~(~(-1)) ISO作用于H9C2心肌細(xì)胞48h建立心肌肥大模型,觀察12-48μg·ml~(~(-1)) MSC-MPs處理肥大心肌細(xì)胞48h后,其對(duì)心肌細(xì)胞表面積、胞內(nèi)總蛋白含量等指標(biāo)的影響,主要包括:用Dimension軟件采集各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖片并測(cè)量心肌細(xì)胞表面積;BCA法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞蛋白含量;q RT-PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞ANP、BNP、β-MHC m RNA水平的變化情況;CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力的改變。實(shí)驗(yàn)分為6組:(1)空白對(duì)照組(Control):加入培養(yǎng)基和等體積無(wú)MPs的PBS;(2)心肌細(xì)胞肥大組(ISO):含5μmol·L~(~(-1)) ISO的培養(yǎng)基;(3)MP(12μg·ml~(~(-1)))組:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和12μg·ml~(~(-1)) MPs的培養(yǎng)基;(4)MP(24μg·ml~(~(-1)))組:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和24μg·ml~(~(-1)) MPs的培養(yǎng)基;(5)MP(48μg·ml~(~(-1)))組:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和48μg·ml~(~(-1)) MPs的培養(yǎng)基;(6)上清液組(Supernatant):含5μmol·L~(~(-1)) ISO和等體積上清液的培養(yǎng)基。為進(jìn)一步分析MSC-MPs的作用機(jī)制,用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的改變。實(shí)驗(yàn)分為以下4組:(1)空白對(duì)照組(Control):加入培養(yǎng)基和等體積無(wú)MPs的PBS;(2)心肌細(xì)胞肥大組(ISO):含5μmol·L~(~(-1)) ISO的培養(yǎng)基;(3)MP(48μg·ml~(~(-1)))組:含5μmol·L~(~(-1)) ISO和48μg·ml~(~(-1)) MPs的培養(yǎng)基;(4)上清液組(Supernatant):含5μmol·L~(~(-1)) ISO和等體積上清液的培養(yǎng)基。結(jié)果1.本實(shí)驗(yàn)獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下呈短梭形、多邊形的集落生長(zhǎng),旋渦狀排列。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線大致呈現(xiàn)“S”形,細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力。MSCs的陽(yáng)性表面標(biāo)志物CD29和CD90的表達(dá)率分別為(97.66±1.30)%、(98.65±0.50)%,陰性表面標(biāo)志物CD45和CD34的表達(dá)率分別為(0.31±0.12)%、(1.90±0.52)%。2.梯度離心法獲得的MSC-MPs,BCA結(jié)果顯示其蛋白濃度為(592.74±5.20)μg·ml~(-1)。流式結(jié)果顯示其數(shù)目為(2.69±0.21)×107個(gè)/ml。流式檢測(cè)結(jié)果顯示,MSC-MPs的表面陽(yáng)性標(biāo)志物CD29和CD90的表達(dá)率分別為(87.61±3.43)%、(98.04±0.61)%,陰性表面標(biāo)志物CD45和CD34的表達(dá)率分別為(2.65±0.47)%、(3.43±0.42)%。3.結(jié)果顯示,在1-30μmol·L~(-1)范圍內(nèi),心肌細(xì)胞表面積隨ISO濃度增加呈現(xiàn)濃度依賴性的增大(P0.001)。用不同濃度的ISO分別作用于心肌細(xì)胞24h和48h后,BCA結(jié)果顯示,ISO濃度在1-30μmol·L~(-1)內(nèi)呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性的增加心肌細(xì)胞蛋白含量。5μmol·L~(-1) ISO作用心肌細(xì)胞48h,細(xì)胞蛋白含量增加了23%(P0.001)。因此,選擇5μmol·L~(-1) ISO作用心肌細(xì)胞48h建立心肌細(xì)胞肥大模型。4.MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞表面積的作用:與ISO組細(xì)胞表面積(1572.90±122.23)μm~2相比,MSC-MPs(12μg·ml~(-1)、24μg·ml~(-1)、48μg·ml~(-1))將細(xì)胞表面積分別減少到(1215.51±107.19)μm~2、(1167.94±46.05)μm~2、(949.71±36.05)μm~2(P0.001)。與ISO組相比,MSCs上清液對(duì)肥大心肌細(xì)胞的表面積無(wú)明顯的作用。5.MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞蛋白含量的作用:與control組相比,ISO組細(xì)胞蛋白含量明顯增多(P0.001)。12-48μg·ml~(-1) MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞呈現(xiàn)濃度依賴性降低細(xì)胞蛋白含量。MSC-MPs濃度在48μg·ml~(-1)時(shí),相比ISO組,細(xì)胞蛋白含量降低最明顯,降低率為24%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。MSCs上清組對(duì)肥大心肌細(xì)胞的蛋白含量未見(jiàn)明顯作用。6.MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞ANP、BNP、β-MHC m RNA的表達(dá)變化:結(jié)果顯示,5μmol·L~(-1) ISO刺激心肌細(xì)胞48h后,ANP、BNP、β-MHC m RNA表達(dá)增加量分別為control組的3.2倍、1.3倍和3.2倍。12~48μg·ml~(-1)濃度范圍內(nèi)MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞m RNA的表達(dá)呈濃度依賴性的抑制作用(P0.05)。上清液組細(xì)胞內(nèi)m RNA表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化。7.ISO和MSC-MPs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示,運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)5μmol·L~(-1) ISO和12、24、48μg·ml~(-1) MSC-MPs均不會(huì)影響H9C2心肌細(xì)胞的增殖能力。8.MSC-MPs對(duì)肥大心肌細(xì)胞ROS含量的變化:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組ROS水平(10.14±0.70)%相比,ISO組ROS水平顯著升高至(53.51±2.91)%(P0.001);使用48μg·ml~(-1) MSC-MPs干預(yù)后,ROS水平降至(11.28±0.59)%,表明MSC-MPs能夠顯著抑制ISO誘導(dǎo)的ROS增加(P0.001)。結(jié)論1.在分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,成功誘導(dǎo)并獲得高質(zhì)量MSC-MPs;2.在12-48μg·ml~(-1)濃度范圍內(nèi),MSC-MPs可顯著抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,該作用可能與其降低心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié) 果2.1 MSCs 的形態(tài)學(xué)特征初始接種于培養(yǎng)瓶中呈現(xiàn)為大小不一的圓形，混有各種血細(xì)胞。48h 后首次換液，鏡下觀察到有細(xì)胞呈短梭形、多邊形的集落生長(zhǎng)。細(xì)胞集落不斷增多，呈“旋渦狀”排列，10 天左右細(xì)胞融合至 85%-90%。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速率加快，4-5天長(zhǎng)滿瓶底進(jìn)行下一次傳代。傳至 2 代后，得到高純度的 MSCs。8 代以內(nèi)細(xì)胞形態(tài)仍為梭形，，生長(zhǎng)代謝旺盛（見(jiàn)圖 1-1）。

圖 1-2 第 5 代 MSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Cs 表面標(biāo)記物的表達(dá)情況驗(yàn)選取第 3 代和第 5 代 MSCs 運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)其表面標(biāo)志液和傳代，血細(xì)胞等雜細(xì)胞幾乎全部被除去，得到 MSCs。第s 的陽(yáng)性表面標(biāo)志物 CD29 和 CD90 的表達(dá)率均在 95%以上，D45 和 CD34 的表達(dá)率均小于 5%（見(jiàn)表 1-1，圖 1-3）。第 3 代面標(biāo)記物表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㧐0.05）。表 1-1 P3 代和 P5 代 MSCs 表面標(biāo)志物的表達(dá)(x ±s，n=3)陽(yáng)性標(biāo)志物（＋） 陰性標(biāo)志物（－CD29 (%) CD90 (%) CD34 (%) C3 代） 97.66±1.30 98.65±0.50 0.31±0.12 1.95 代） 97.72±1.22 98.57±0.48 0.36±0.11 2.3
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2666321