【摘要】：目的動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種常見的血管病變,其特點是動脈血管壁炎癥的發(fā)生和脂質(zhì)斑塊的形成。目前認為,AS是血脂、血糖和炎癥等危險因素與遺傳易感基因相互作用的結(jié)果。隨著遺傳學研究手段的發(fā)展,傳統(tǒng)的基因調(diào)控模式已經(jīng)很難完全解釋心血管疾病和環(huán)境變量之間的互作關(guān)系。心血管疾病中的表觀遺傳調(diào)控作用越來越受到關(guān)注。表觀遺傳學指在不改變核苷酸序列的情況下,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。表觀遺傳調(diào)控是基因與環(huán)境相互作用的橋梁,DNA甲基化是目前研究最明確也是最廣泛的表觀遺傳標記。近年研究證實,全基因組DNA甲基化程度與AS發(fā)生密切相關(guān)。局部DNA高甲基化調(diào)控通過改變AS調(diào)控相關(guān)基因表達參與了AS發(fā)生及演進,但具體的作用靶點和作用機制仍然不十分清楚。E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控因子,是從子宮頸內(nèi)膜癌Hela細胞cDNA文庫中克隆出來。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),CREG是重要的組織和細胞分化穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子。CREG在人正常血管內(nèi)皮細胞中高表達,而CREG在AS血管內(nèi)皮細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達均顯著降低。我們進一步研究證實,過表達CREG基因能夠?qū)笰S發(fā)生,但其下調(diào)的分子機制一直未闡明。我們應(yīng)用生物信息學軟件分析發(fā)現(xiàn),人CREG基因的第一外顯子區(qū)存在大量的CpG島,提示DNA甲基化可能參與AS血管內(nèi)皮細胞中CREG基因表達的調(diào)控�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,我們提出科學假說,CREG基因通過調(diào)控DNA甲基化參與AS的發(fā)生。因此,本研究以DNA甲基化調(diào)控為切入點,探討在AS獨立危險因素氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,OX-LDL)刺激下,CREG在人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中表達下調(diào)的甲基化調(diào)控機制,并為AS的防治提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。方法(1)采用OX-LDL和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)分別作用于原代培養(yǎng)的HUVEC,通過Western blot和定量PCR檢測CREG、甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的表達。初步確定人CREG基因表達與甲基化的相關(guān)性。(2)通過生物信息學軟件預測分析明確人CREG基因啟動子區(qū)的CpG島的位置;通過構(gòu)建CREG啟動子區(qū)熒光素酶報告基因載體并進行基因表達活性檢測分析,明確CpG島對CREG基因表達的調(diào)控作用及具體調(diào)控區(qū)域。(3)應(yīng)用OX-LDL增加原代培養(yǎng)HUVEC細胞甲基化水平,應(yīng)用5-Aza-CdR抑制原代HUVEC甲基化表達后,提取HUVEC基因組DNA,進行焦磷酸測序,以明確CREG基因啟動子區(qū)關(guān)鍵CpG島甲基化位點。進一步通過構(gòu)建含CREG基因關(guān)鍵CpG島甲基化突變位點的熒光素酶報告基因載體和熒光素酶活性檢測,明確具體的甲基化位點對CREG基因表達的調(diào)控作用。結(jié)果(1)應(yīng)用不同濃度的OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)作用原代HUVEC,Western blot和定量PCR檢測CREG和DNMTs的表達。結(jié)果顯示:隨著OX-LDL濃度的增加,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在RNA和蛋白水平表達均顯著增加,CREG表達減少。將不同濃度的5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用原代HUVEC細胞抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表達后,CREG轉(zhuǎn)錄及表達顯著增加。以上結(jié)果提示:人CREG基因轉(zhuǎn)錄表達與HUVEC甲基化水平負性相關(guān)。(2)通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn),人CREG基因的第一外顯子區(qū)存在明顯的CpG島(-48/+588)。進一步應(yīng)用含有不同啟動子片段的熒光素酶報告基因載體活性檢測證實,CpG島對CREG表達呈負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,其中+79/+255為關(guān)鍵負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。(3)分別應(yīng)用OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)和5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用于原代HUVEC后,行CREG啟動子+79/+255區(qū)域的焦磷酸測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過OX-LDL處理后,CREG基因關(guān)鍵CpG島甲基化水平較對照組增加,而經(jīng)過5-Aza-CdR處理后,CREG基因關(guān)鍵CpG島甲基化水平較對照組減少。以上結(jié)果表明,OX-LDL促進CREG基因啟動子區(qū)CpG島(+201/+255)片段的甲基化水平增高。隨后,分別構(gòu)建+201/+255片段中8個CG位點突變的熒光素酶報告基因載體并行熒光素酶活性檢測分析。結(jié)果證實,CREG基因啟動子區(qū)的關(guān)鍵甲基化調(diào)控位點為+201/+202。綜上所述,CREG基因啟動子區(qū)甲基化變化影響CREG基因的表達,關(guān)鍵的甲基化調(diào)控位點為+201/+202。結(jié)論在OX-LDL作用下,CREG基因啟動子區(qū)局部CpG島高甲基化,下調(diào)CREG表達而導致AS的發(fā)生。這可能是AS始動階段,內(nèi)皮細胞中CREG蛋白缺失的關(guān)鍵調(diào)控機制之一。
【圖文】：

圖 1-1 Real-time PCR 檢測 OX-LDL 及 5-Aza-CdR 刺激 HUVEC 細胞 CREG 和DNMTs mRNA 表達注：與對照組（OX-LDL 0μg/mL，5-Aza-CdR 0μM）相比，** P<0.01，*** P<0.001，，n=3。（二）應(yīng)用不同濃度 OX-LDL 及 5-Aza-CdR 刺激原代 HUVEC，觀察 CREG 表達與 DNMTs 蛋白表達相關(guān)關(guān)系應(yīng)用不同濃度 OX-LDL（50μg/mL 和 100μg/mL）刺激 HUVEC 24h 后，Western-blot 方法檢測 CREG 和 DNMTs 蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著OX-LDL濃度的增加，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達升高，而CREG的表達降低。當 OX-LDL 濃度為 100μg/mL 時，DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b的表達顯著升高（P<0.001，圖 1-2），CREG 的表達顯著降低（P<0.01，圖 1-2），

圖 1-2 Western-blot 檢測不同濃度 OX-LDL 及 5-Aza-CdR 作用后，HUVEC 中CREG 和 DNMTs 蛋白表達變化注：與對照組（OX-LDL 0μg/mL，5-Aza-CdR 0μM）相比，** P<0.01，*** P<0.001n=3。討 論AS 的發(fā)生機制復雜, 至今仍未闡明。目前認為，脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等多種因素所致的血管內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的始動因素[30]。近年來，人們逐漸認識到 AS 的發(fā)生是遺傳因素、表觀遺傳因素和外界環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。DNA 甲基化調(diào)控是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的一種重要的表觀遺傳學方式，其在腫瘤發(fā)生中的作用[31]已被廣泛認識，它在其他疾病發(fā)生如炎
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊桂棠;韓雅玲;閆承慧;田孝祥;李洋;;過表達CREG抑制ox-LDL誘導的人血管平滑肌細胞增殖[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年36期

本文編號：2665575