【摘要】：骨髓增生異常綜合征(Myelodys0plastic Syndromes,MDS)是一組具有高度危險(xiǎn)性向急性髓系白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)轉(zhuǎn)化的髓系克隆性疾病。目前,MDS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未清楚,有研究表明骨髓的血管新生參與MDS的發(fā)病機(jī)制,骨髓血管新生成為MDS發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是缺氧條件下參與血管生成的重要調(diào)控因子,與VEGF共同參與血管生成。而血小板衍生生長因子-B(Platelet derived growth factor subunit B,PDGF-B)是PDGF家族中一員,也是血管新生的調(diào)控因子。有研究表明HIF-1α與PDGF-B的表達(dá)具有相關(guān)性,并且共同參與侵襲性乳腺癌的血管生成通路。目前,僅有一篇英文文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1α與MDS的發(fā)生和預(yù)后有一定的相關(guān)性,然而PDGF-B在MDS中尚未有研究。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類長度短小的非編碼單鏈RNA,它能與其靶向的基因相結(jié)合,抑制靶基因的蛋白翻譯或降解靶基因的mRNA,從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)和其生物學(xué)功能。本課題組結(jié)合前期工作,進(jìn)一步研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表達(dá)意義和相關(guān)性;并發(fā)現(xiàn)miR-93-5p與HIF-1α和PDGF-B有結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而研究miR-93-5能否靶向結(jié)合HIF-1α和PDGF-B在MDS中發(fā)揮生物學(xué)功能。材料和方法1.收集82例MDS患者、12例MDS轉(zhuǎn)AML患者以及33例(未累及骨髓的淋巴瘤患者)對照患者共127例骨髓組織蠟塊,采用免疫組織化學(xué)法檢測所有骨髓組織蠟塊中HIF-1α和PDGF-B的蛋白表達(dá)水平,并結(jié)合臨床參數(shù)分析HIF-1α和PDGF-B在MDS以及AML中的表達(dá)意義。2.在GEO、ArrayExpress、Pubmed數(shù)據(jù)庫中,通過檢索并篩選含有MDS和對照組或含有AML和MDS的基因芯片或文獻(xiàn);接著,對MDS相關(guān)基因芯片進(jìn)行差異基因的分析,并對篩選出來的差異基因并進(jìn)行通路富集等生物學(xué)功能分析。3.提取MDS相關(guān)基因芯片中HIF-1α和PDGF-B的表達(dá)數(shù)據(jù),分析芯片數(shù)據(jù)中HIF-1α和PDGF-B的表達(dá)水平與MDS、AML的關(guān)系,并進(jìn)行連續(xù)型變量合并SMD的meta分析和聯(lián)合診斷SROC的meta分析,進(jìn)一步分析基因芯片中HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表達(dá)意義。4.通過對CCLE、GEPIA和THE HUMAN PROTEIN ATLAS數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)提取,獲取HIF-1α和PDGF-B在Pan cancer中的表達(dá)情況,分析HIF-1α和PDGF-B的表達(dá)水平與腫瘤的關(guān)系。5.通過MEM數(shù)據(jù)庫分別獲取HIF-1α和PDGF-B的相關(guān)基因,對兩個(gè)基因集取交集得到的基因進(jìn)行通路富集等生物功能分析,進(jìn)而對HIF-1α和PDGF-B的表達(dá)意義進(jìn)行進(jìn)一步的探索與驗(yàn)證。6.通過miRWalk數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,通過篩選與HIF-1α和PDGF-B均靶向結(jié)合并且有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA,并與GSE76775芯片中的MDS與對照組的差異miRNA取交集,找出能靶向結(jié)合HIF-1α和PDGF-B的miRNA。7.通過starBase V2.0數(shù)據(jù)庫發(fā)掘HIF-1α和PDGF-B與miR-93-5p在其他腫瘤中的相關(guān)性;并通過OncomiR、YM500數(shù)據(jù)庫獲取miR-93-5p在Pan cancer中的表達(dá)情況,進(jìn)一步探究腫瘤中miR-93-5p與HIF-1α和PDGF-B的關(guān)系。8.通過雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證miR-93-5p是否在MDS中能靶向結(jié)合HIF-1α,驗(yàn)證HIF-1α和PDGF-B能否作為miR-93-5p的靶基因在MDS中發(fā)揮生物學(xué)功能。結(jié)果(一)使用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究HIF-1α和PDGF-B在MDS組織中的表達(dá)及其意義1.通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),HIF-1α在MDS組骨髓組織中的陽性率(90.24%)高于對照組骨髓組織中的陽性率(72.73%),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),這提示HIF-1α在MDS骨髓組織中表達(dá)上調(diào)。2.在MDS患者中,HIF-1α(+)患者的白細(xì)胞數(shù)(均值=3.65×10~9/L)顯著多于HIF-1α(-)患者的白細(xì)胞數(shù)(均值=2.51×10~9/L)(P0.001);而且HIF-1α(+)患者的中性粒細(xì)胞(均值=1.92×10~9/L)顯著多于HIF-1α(-)患者的中性粒細(xì)胞(均值=1.31×10~9/L)(P0.05)。通過對HIF-1α(+)的患者進(jìn)行生存分析,發(fā)現(xiàn)在性別、WHO分型、染色體核型預(yù)后、IPSS分級和原始細(xì)胞百分比的分組組別中,生存時(shí)間有顯著差異(P0.05);而且在與MDS不良預(yù)后相關(guān)的組別(男性組、RAEB1/RAEB2組、染色體預(yù)后不良組、IPSS高危組和原始細(xì)胞≥5%組)中,其平均生存期較短。3.通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),PDGF-B在MDS組骨髓組織中的陽性率(98.78%)高于對照組骨髓組織中的陽性率(78.79%),并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),這表明PDGF-B在MDS骨髓組織中的表達(dá)上調(diào)。4.通過對PDGF-B(+)的患者進(jìn)行生存分析,發(fā)現(xiàn)在性別、WHO分型、染色體核型預(yù)后、IPSS分級和原始細(xì)胞百分比的組別中生存時(shí)間有顯著差異(P0.05),而且在男性組、RAEB1/RAEB2組、染色體預(yù)后不良組、IPSS高危組和原始細(xì)胞≥5%組中,這些與MDS不良預(yù)后相關(guān)的組別的平均生存期較短。5.對HIF-1α和PDGF-B的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)在MDS骨髓組織中HIF-1α和PDGF-B的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.19,P0.05)。(二)使用計(jì)算生物學(xué)研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表達(dá)和意義1.從14個(gè)與MDS相關(guān)的基因芯片中獲得310個(gè)差異基因,這些差異基因主要參與B細(xì)胞活化、B細(xì)胞受體信號通路、造血細(xì)胞譜系、TGF-β信號通路和EGF受體信號傳導(dǎo)途徑等,通過PPI(Protein-protein interaction)分析發(fā)現(xiàn)CD19、TLR4、IRF4、CXCR4、APAF1等是整個(gè)PPI的核心節(jié)點(diǎn)。2.HIF-1α在GSE2779、GSE18366、GSE41130和GSE61853芯片中,MDS組的平均表達(dá)水平高于對照組;尤其是在GSE18366芯片中,MDS組的HIF-1α的水平顯著高于對照組的水平(P0.05),且在ROC診斷試驗(yàn)中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(AUC=0.77,P0.05)。PDGF-B在GSE4619、GSE18366、GSE30195、GSE30201、GSE41130、GSE43399、GSE51757、GSE58831、GSE81173和GSE15061芯片中,MDS組的平均表達(dá)水平高于對照組;在GSE30201和GSE81173芯片中,MDS組的PDGF-B的水平顯著高于對照組的水平(P0.01),且在ROC診斷試驗(yàn)中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(AUC=0.80,P0.05和AUC=0.83,P0.05);表明PDGF-B不僅在MDS基因芯片中表達(dá)上調(diào),且對MDS具有一定的診斷意義。3.PDGF-B在MDS組和對照組的14個(gè)芯片數(shù)據(jù)中,用固定效應(yīng)模型進(jìn)行meta分析,SMD=0.27(0.09,0.44),z值為2.60,P值為0.009,表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PDGF-B在MDS基因芯片中表達(dá)上調(diào);PDGF-B的合并敏感度為0.63(0.48-0.76),合并特異度為0.74(0.57-0.86),SROC曲線下面積為0.74(0.70-0.78)。PDGF-B對MDS有中等診斷價(jià)值。4.HIF-1α在GSE15061(p0.05)中,AML組表達(dá)水平高于MDS組;而在GSE25300(p0.05)、GSE51082和GSE61804(p0.05)中,AML組表達(dá)水平低于MDS組。PDGF-B在GSE51082(p0.001)和GSE15061中,AML組表達(dá)水平高于MDS組;而在GSE25300和GSE61804(p0.01)中,AML組表達(dá)水平低于MDS組。5.HIF-1α在AML組和MDS組的4個(gè)芯片數(shù)據(jù)中,用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行meta分析,SMD檢測的z值為1.11,P值為0.266,異質(zhì)性檢驗(yàn)I~2=83.7%,P0.001,菱形與無效線相交,表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HIF-1α的合并敏感度為0.59(0.49-0.69),合并特異度為0.90(0.77-0.96),SROC曲線下面積為0.78(0.74-0.82)。PDGF-B在AML組和MDS組的4個(gè)芯片數(shù)據(jù)中,用固定效應(yīng)模型進(jìn)行meta分析,SMD檢測的z值為0.10,P值為0.922,異質(zhì)性檢驗(yàn)I~2=85.9%,P0.001,菱形與無效線相交,表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PDGF-B的合并敏感度為0.63(0.48-0.76),合并特異度為0.74(0.57-0.86),SROC曲線下面積為0.74(0.70-0.78)。6.在GEPIA數(shù)據(jù)庫30種腫瘤數(shù)據(jù)中,HIF-1α在24種腫瘤中的表達(dá)上調(diào),尤其是在食管癌、頸部鱗狀細(xì)胞癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、低級別腦膠質(zhì)瘤、急性骨髓性白血病和胃腺癌中顯著上調(diào)。而PDGF-B在腫瘤中表達(dá)有差異,在15種腫瘤組織的表達(dá)上調(diào),特別是淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、卵巢漿液性囊腺癌、胰腺癌、胸腺瘤中中顯著上調(diào)。7.在MEM數(shù)據(jù)庫中獲取到HIF-1α和PDGF-B均有相關(guān)的605個(gè)基因,進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與癌癥途徑、TNF信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、病毒癌變、MAPK信號傳導(dǎo)途徑、胰腺癌等。通過PPI分析發(fā)現(xiàn)JUN、UBC、VEGFA、RELA、CALM1等蛋白是整個(gè)PPI的核心節(jié)點(diǎn)。(三)HIF-1α和PDGF-B在MDS中作為MiR-93-5p靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能1.通過選擇miRWalk數(shù)據(jù)庫中的四個(gè)預(yù)測靶基因的平臺(tái)分別預(yù)測HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,取兩個(gè)基因均大于或等于4個(gè)平臺(tái)都共有的miRNA與GSE76775芯片中的MDS與對照組的差異miRNA交集,發(fā)現(xiàn)有且僅有mir-93-5p能同時(shí)靶向結(jié)合HIF-1α和PDGF-B基因。2.利用starBase V2.0數(shù)據(jù)庫,在Pan-cancer project中發(fā)現(xiàn),HIF-1α和PDGF-B與miR-93-5p在多種腫瘤中呈負(fù)相關(guān)性。MiR-93-5p與HIF-1α在尿路上皮膀胱癌、結(jié)直腸腺癌、透明細(xì)胞腎癌、急性粒細(xì)胞白血病和乳頭狀甲狀腺癌呈負(fù)相關(guān)。PDGF-B與miR-93-5p在乳腺癌、結(jié)直腸腺癌、肺腺癌、肺鱗癌、在子宮體子宮內(nèi)膜癌、皮膚黑素瘤和卵巢漿液性囊腺癌呈負(fù)相關(guān)。MiR-93-5p與HIF-1α、PDGF-B在腫瘤中呈負(fù)相關(guān)性,進(jìn)一步的提示HIF-1α和PDGF-B可能作為miR-93-5p的靶基因在MDS中發(fā)揮作用。3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-93-5p能靶向結(jié)合HIF-1α,驗(yàn)證HIF-1α和PDGF-B可能作為miR-93-5p的靶基因在MDS中發(fā)揮生物學(xué)功能。結(jié)論1.HIF-1α在MDS骨髓組織中表達(dá)上調(diào);且在HIF-1α(+)的患者中,MDS患者的生存時(shí)間與不良預(yù)后因素相關(guān);再者,HIF-1α(+)有助于MDS的診斷。2.PDGF-B在MDS骨髓組織中表達(dá)上調(diào);且在PDGF-B(+)的患者中,MDS患者的生存時(shí)間與不良預(yù)后因素相關(guān);再者,PDGF-B(+)有助于MDS的診斷。3.在MDS中,HIF-1α和PDGF-B均表達(dá)上調(diào),而且兩者呈正相關(guān)。4.MiR-93-5p靶向結(jié)合HIF-1α;在MDS中miR-93-5p可能通過靶向結(jié)合HIF-1α和PDGF-B發(fā)揮生物學(xué)功能,但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以進(jìn)一步驗(yàn)證。
【圖文】：
1 微環(huán)境在骨髓增生異常綜合征的發(fā)生和演變中的作用模型的簡潔假說圖。ure 1 A hypothetical and simplified working model for the role of the microenvironment in the init evolution of myelodysplastic syndromes.缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)是維持缺
HIF-1α在MDS和正常對照組的骨髓細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R551.3
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本文編號：
2665004
