【摘要】：隨著人民生活水平的提高、生活節(jié)奏加快,缺血性心臟病已成為我國居民心血管病死亡率上升的主要原因,也是我國重大慢性非傳染性的公共衛(wèi)生問題。經(jīng)皮冠脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)是治療冠心病急性心肌梗死的主要措施,可直接作用于梗塞部位、使病變冠脈再通,從而改善心肌供血。然而,隨著對缺血性心臟病發(fā)病機制認識的不斷深入,中外學者發(fā)現(xiàn):除了傳統(tǒng)的慢性阻塞性冠狀動脈疾病(Coronary artery disease,CAD),冠脈微血管功能障礙也是造成心肌缺血的重要原因,心外膜大血管的開通≠心肌水平的再灌注。在部分患者中,即使開通梗死相關(guān)動脈(Infarct related Artery,IRA),受損心肌仍未得到有效的血流灌注,這種微循環(huán)障礙的現(xiàn)象稱之為無復(fù)流(no reflow,NR)。事實上,每年我國PCI術(shù)后無復(fù)流的發(fā)生率在5%-25%之間。一旦發(fā)生無復(fù)流,常伴有廣泛而嚴重的心肌損害,患者可出現(xiàn)左室擴張、心功能下降和惡性心律失常,最終增加猝死、充血性心力衰竭等心血管不良事件發(fā)生的風險。可見,早期發(fā)現(xiàn)及診斷PCI術(shù)后的微循環(huán)障礙是必要的。大量的流行病學及臨床研究發(fā)現(xiàn)了很多可導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化的危險因素。但是,傳統(tǒng)的危險因素只能部分解釋冠心病的發(fā)生,研究發(fā)現(xiàn)有些冠心病患者并不具有傳統(tǒng)的危險因素,而與血漿同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平的升高密切相關(guān)。高Hcy水平與冠心病的病死率呈正相關(guān),Hcy每增加5umol/L,冠心病死亡率可增加1.52倍。為何伴高同型半胱氨酸血癥的冠心病患者無論是血管病變程度(多支血管病變)、還是血管狹窄程度、甚至支架內(nèi)再狹窄,以及心肌梗死后的死亡率均高于正常同型半胱氨酸水平患者。其中的機制尚無深入研究。是否因為Hcy加重了冠脈微循環(huán)障礙,而造成預(yù)后不良,這尚未見報道。尼可地爾為作用于三磷酸腺苷敏感型鉀離子通道開放劑(ATP-sensitive potassium channel,KATP),既可通過開放血管平滑肌上的ATP敏感鉀離子通道開放劑,通道有效擴張微小冠脈,增加缺血區(qū)的血氧供應(yīng);又能開放心肌線粒體膜上的KATP通道模擬缺血預(yù)適應(yīng),減少缺血對心肌的損傷。因此,在臨床上常用來治療心絞痛患者。薈萃分析也證實:圍PCI期應(yīng)用尼可地爾可顯著減少慢/無復(fù)流現(xiàn)象,降低心梗后心衰發(fā)生率,改善心功能以及長期預(yù)后。因此,尼可地爾是否能夠逆轉(zhuǎn)伴有高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)的冠心病患者的愈后,改善冠脈微循環(huán)功能障礙,取得冠心病治療特別是伴HHcy冠心病這一類患者治療的突破,是我們進一步探討的問題。本研究的目的在于:1)利用HHcy+心肌梗死模型探討Hcy是否通過損傷內(nèi)皮細胞,導(dǎo)致冠脈微循環(huán)障礙,心肌細胞缺乏充足血供,而加重冠心病的不良預(yù)后;2)在此基礎(chǔ)上研究尼可地兒是否可逆轉(zhuǎn)伴隨HHcy冠心病的微循環(huán)障礙;3)探索尼可地爾對于NO生成和抑制炎癥反應(yīng)等是否參與到HHcy致冠脈微循環(huán)障礙的機制當中,從而尋找靶向治療方法,改善HHcy所致的冠心病嚴重病變及不良預(yù)后。第一部分高同型半胱氨酸加重心梗后小鼠的冠脈微循環(huán)損害目的:研究高同型半胱氨酸對小鼠心梗后的冠脈微循環(huán)損害。方法:1.將7周C57BL/6的雄性小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為三組,分別為對照組:普通全價飼料喂養(yǎng)及飲用雙蒸水;高同型半胱氨酸組:含(1.8g/L)同型半胱氨酸雙蒸水喂養(yǎng)及普通飼料;葉酸組:高氨酸組+葉酸組,葉酸混懸液,用量為0.071ug/g/day,灌胃,喂養(yǎng)時間為8周;2.分別采用無創(chuàng)鼠尾動脈血壓儀檢測小鼠的收縮壓/舒張壓;Hcy試劑盒檢測血漿Hcy水平;3.結(jié)扎小鼠左冠狀動脈前降支,建立急性心肌梗死模型。使用四唑紅(Tetramethylethylenediamine,TTC)染色法、心電圖明確心梗模型建立。4.通過SPSS19.0分析小鼠的生存曲線對比兩組之間的關(guān)系。5.小動物超聲檢測心梗后小鼠心臟功能;6.4周后將所有小鼠處死,通過免疫熒光染色,在顯微鏡下觀察缺血心肌組織的血管生成情況。7.番茄凝集素染色評估心梗后微循環(huán)數(shù)量變化。結(jié)果:1.小鼠喂養(yǎng)Hcy 8周后血漿中Hcy濃度明顯高于正常飲食組(P0.05),而葉酸組Hcy水平顯著降低。同時HHcy組的收縮壓、舒張壓較正常組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。2.建立心梗小鼠模型,結(jié)扎前降支血管,肉眼可見心肌組織有紅色變?yōu)樯n白,心電圖可見動態(tài)ST改變,TTC染色可見灰白色心梗區(qū)域,證明小鼠心梗模型建立成功。3.將小鼠分為:假手術(shù)組(正常飲食組)、心梗組(正常飲食+心梗組)、HHcy組(HHcy心梗組)、葉酸組(HHcy心梗+葉酸組)。各組小鼠術(shù)后28天死亡率對比,與正常組相比,心梗組小鼠的生存率明顯下降(P0.01),而HHcy組低于正常飲食組(P0.05),葉酸組小鼠生存率有所提高。4.HHcy對心梗后小鼠心功能影響,左心室射血分數(shù)(Left ventricular ejectionfractions,LVEF)、左心室短軸縮短率(Left ventricular Fraction Shortening,LVFS)在HHcy心梗組均低于非HHcy心梗組(P0.05),同時HHcy心梗組左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter,LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic dimension,LVIDs)高于非Hcy心梗組小鼠(P0.05)。而葉酸補充治療,Hcy水平降低組,LVEF、LVFS升高,LVIDd、LVIDs下降。5.心梗組心肌CD31的表達強度較假手術(shù)組明顯下降,HHcy心梗小鼠的CD31表達下降更明顯(P0.05),葉酸組治療后心肌CD31的表達可以提高(P0.05)。6.心梗組番茄凝集素熒光的強度較正常組明顯減弱,HHcy組小鼠的下降程度較心梗組下降程度更大(P0.05),葉酸組小鼠的熒光強度有增強(P0.05)。結(jié)論:1.伴HHcy可影響心梗后小鼠的血管再生功能以及微循環(huán)功能,從而影響心功能,加重心梗后小鼠死亡率的發(fā)生。2.葉酸補充,可降低Hcy,部分逆轉(zhuǎn)上述改變,保護心梗后小鼠的微循環(huán)障礙以及血管再生功能,對改善小鼠心功能、生存率有促進作用。第二部分尼可地爾改善HHcy小鼠心梗后微循環(huán)障礙目的:建立在體小鼠心肌梗死模型,評估尼可地爾預(yù)處理能否改善伴HHcy心梗后小鼠的微循環(huán)功能障礙。方法:1.小鼠隨機分為7組:1)假手術(shù)組(Sham組):正常飼養(yǎng)無其他處理;2)常規(guī)飲食+心梗組(myocardial infarction,MI組):正常飼養(yǎng)喂養(yǎng)+小鼠心梗組;3)HHcy+MI組:HHcy飲食喂養(yǎng)+小鼠心梗組;4)尼可地爾1組(HHcy+MI組+低劑量尼可地爾組,尾靜脈注射尼可地爾5mg/kg);5)尼可地爾2組(HHcy+MI組+中等劑量尼可地爾組,尾靜脈注射尼可地爾15mg/kg);6)尼可地爾3組(HHcy+MI組+高劑量尼可地爾組,尾靜脈注射尼可地爾45mg/kg);7)Vehicle組(HHcy+MI+PBS對照組,經(jīng)尾靜脈注射等量PBS)。2.預(yù)處理尼可地爾對心梗后小鼠生存率、心臟彩超的指標變化;3.蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色心梗后小血管的出血情況以心肌組織變化,蘇木素-堿性品紅苦味酸(Hematoxylin baisic fuchsi picric acid dyeing,HBFP)各組心肌缺血組織的變化,4.通過CD31免疫熒光染色,在顯微鏡下觀察缺血心肌組織的血管生成情況。5.番茄凝集素評估心梗后小鼠的微循環(huán)功能結(jié)果:1.隨著尼可地爾治療的濃度升高,HHcy+MI組小鼠的存活率得到改善。2.HHcy心梗后小鼠心功能下降,LVEF、LVFS組明顯下降,且LVIDd、LVIDs比正常組擴大,而尼可地爾的預(yù)處理可以使得心梗后小鼠的LVEF、LVFS值升高,同時較LVIDd、LVIDs HHcy心梗組縮小(P0.05)。3.HE染色結(jié)果可見:正常心肌組織染色心肌橫紋清晰,細胞膜完整,未見炎細胞浸潤;而心梗組小鼠心肌組織可見紅細胞滲出及炎細胞浸潤;HHcy心梗組小鼠除了見到炎性細胞浸潤,還可見大量纖維化組織增生;尼可地爾預(yù)處理各組小鼠的心肌組織病理變化都有明顯好轉(zhuǎn),肌纖維及間質(zhì)水腫減輕,炎性細胞浸潤減少。4.缺血心肌HBFP染色結(jié)果,HHcy+MI組缺血面積較MI組增大(P0.05),而尼可地爾可減輕HHcy+MI組缺血面積,但在Nic2組、Nic3組與HHcy+MI組才有統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.番茄凝集素實驗結(jié)果現(xiàn)實,與MI組對比,HHcy+MI組小鼠微循環(huán)損傷更嚴重(P0.05),尼可地爾2、3組可以改善心梗后小鼠微循環(huán)功能,心梗后熒光強度較HHcy+MI組明顯升高(P0.05)。6.對心肌缺血小鼠血管內(nèi)皮細胞CD31染色,顯微鏡下觀察心肌組織的熒光強度,發(fā)現(xiàn)HHcy+MI組的熒光明顯較其它各組減弱,而尼可地爾2、3組,熒光強度升高,血管再生能力增強(P0.05)。結(jié)論:1.尼可地爾能夠改善HHcy心梗小鼠后的心功能、28天生存率。2.尼可地爾預(yù)處理能夠有效改善心梗后小鼠的心肌組織的血管損傷,縮小心肌缺血的面積。3.尼可地爾提高心梗后心肌的血管生成能力,同時改善微循環(huán)功能。第三部分尼可地爾對HHcy小鼠心梗后微循環(huán)障礙的保護機制研究目的:本研究利用HHcy心梗小鼠在體模型,以及利用冠狀動脈內(nèi)皮細胞建立HHcy/缺血缺氧損傷體外模型,探討尼可地爾HHcy小鼠心梗后微循環(huán)障礙的機制,觀察PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與其中,明確尼可地爾調(diào)節(jié)NO和抑制炎癥反應(yīng),發(fā)揮保護微循環(huán)損傷的作用機制。方法:在體試驗-動物部分1.小鼠隨機分為5組:1)假手術(shù)組(Sham組):正常飼養(yǎng)無其他處理;2)HHcy+MI組:HHcy飲食喂養(yǎng)+小鼠心梗組;3)尼可地爾組(HHcy+MI組+中等劑量尼可地爾組,尾靜脈注射尼可地爾15mg/kg,最適合濃度);4)LY294002組(在結(jié)扎血管前,經(jīng)尾靜脈緩慢推注0.3mg/kg的PI3K特異性抑制劑LY294002,余同尼可地爾組;5)L-NAME組(在結(jié)扎血管前,經(jīng)尾靜脈緩慢推注0.3mg/kg的NO合成酶抑制劑L-NAME,余同尼可地爾組)。2.不同處理組對心梗后小鼠生存率、心臟彩超的指標變化;3.通過CD31免疫熒光染色,在顯微鏡下觀察缺血心肌組織的血管生成情況。4.番茄凝集素評估心梗后小鼠的微循環(huán)功能5.采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定心臟血漿中IL-1β、IL-6,NO以及ET-1的含量。6.通過Western Blot檢測心肌缺血區(qū)域PI3K/Akt/eNOS的表達。體外試驗-細胞部分:1.HHcy缺血/缺氧模型的建立:不同的HHcy濃度以及缺氧時間的摸索。分組為:24小時Hcy濃度0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L,缺氧時間分別為3h、6h、9h。2.采用噻唑藍(Thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法檢測檢測各組不同濃度Hcy和缺氧時間對冠脈內(nèi)皮細胞生長的影響。采用乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)檢測試劑盒檢測各組心肌細胞LDH漏出率,3.采用Western-blotting法檢測各組磷酸化eNOS蛋白的表達情況。4.不同濃度的尼克地爾對HHcy缺血/缺氧模型的保護。實驗分組如下:1.control組;2.HHcy+Hypoxia 6h組;3.Nic0組(HHcy+Hypoxia6h+PBS組);4.Nic 50u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 50umol/L);5.Nic 100u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 100umol/L);6.Nic 125u M(HHcy+Hypoxia 6h+Nicorandil 125umol/L)。5.采用Western-blotting法檢測各組PI3K/Akt/eNOS蛋白的表達情況,同時提取細胞上清液測定NO水平。6.q RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6m RNA表達水平的變化。7.PI3K抑制劑LY294002,eNOS抑制劑L-NAME預(yù)處理后,尼可地爾保護作用的改變,Western-blotting法檢驗P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS的變化;8.劃痕實驗觀察尼可地爾對內(nèi)皮細胞遷移功能,小管成形觀察實驗?zāi)峥傻貭枌ρ苄纬傻挠绊�。結(jié)果:1.HHcy心梗后小鼠生存率提高(P0.05),但是在PI3K抑制劑、eNOS抑制劑的作用下,尼可地爾的對HHcy心梗小鼠的生存率保護作用消失(P0.05);2.HHcy心梗后小鼠與正常組對比,LVEF、LVFS組下降,且LVIDd、LVIDs擴大,而尼可地爾的預(yù)處理可以使得心梗后小鼠的LVEF、LVFS值升高,同時縮小LVIDd、LVIDs(P0.05)。但在PI3K抑制劑、eNOS抑制劑的作用下,LVEF、LVFS,LVIDd、LVIDs值與HHcy心梗組無明顯改善(P0.05);3.心肌組織CD31熒光染色,發(fā)現(xiàn)HHcy心梗組的熒光強度明顯較其它各組少,而尼可地爾治療組,熒光強度升高(P0.05),但在LY294002組、L-NAME組,熒光強度與HHcy心梗組無升高。4.番茄凝集素實驗結(jié)果現(xiàn)實,尼可地爾組可以改善心梗后小鼠微循環(huán)功能,心梗后熒光強度較心梗組明顯升高(P0.05),但在LY294002組、L-NAME組與HHcy心梗組對比無明顯差異。5.與Sham組對比,HHcy心梗組的IL-1β、IL-6水平明顯升高(P0.05),而尼可地爾的使用可以降低小鼠血漿中IL-1β、IL-6水平。6.HHcy心梗后小鼠血漿中的NO降低、ET-1水平升高;尼可地爾能夠提提高NO水平、降低ET-1的水平(P0.05)。但在LY294002組、L-NAME組,磷酸化e NO的表達,NO、ET-1水平與HHcy心梗組無明顯異(P0.05)。7.與Sham組相比,HHcy心梗后心肌缺血組織的磷酸化PI3K、Akt、eNOS值下降(P0.05);尼可地爾治療后P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS比值升高(P0.05);但是在LY294002組,P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS與HHcy心梗組無區(qū)別(P0.05);在L-NAME組,PI3K/PI3K、P-Akt/Akt升高(P0.05),P-eNOS/eNOS仍降低。8.體外實驗中,與正常組相比較,Hcy誘導(dǎo)的冠脈內(nèi)皮細胞中細胞的活力隨著Hcy濃度升高而逐漸降低,同時蛋白水平p-eNOS/eNOS的比例也下降(P0.05);而且隨著缺氧時間的增長,細胞的活力也出現(xiàn)下降的趨勢。而給予尼克地爾處理后,內(nèi)皮細胞的活力增強(P0.05)、乳酸脫氫酶活性降低(P0.05)。9.與正常組相比,模型組NO水平明顯下降,內(nèi)皮細胞磷酸化的PI3K、Akt、eNOS的比值也降低(P0.05),而IL-1β、IL-6水平明顯升高(P0.05)。尼克地爾隨著濃度的升高對可以提高P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-eNOS/eNOS的比值升高(P0.05),升高NO水平(P0.05),減少細胞IL-1β、IL-6水平(P0.05)。10.當尼可地爾與PI3K抑制劑聯(lián)合使用時,對細胞內(nèi)Akt、eNOS的調(diào)控作用顯著降低(P0.05);當尼可地爾與eNOS抑制劑聯(lián)合使用時對PI3K、Akt的調(diào)控作用仍在,但其對eNOS的調(diào)控作用減弱。11.尼可地爾可以提高模型組細胞的遷徙功能,以及血管形成作用(P0.05)。但是當與PI3K抑制劑、eNOS抑制劑聯(lián)合使用時,對細胞內(nèi)皮功能的改變作用消失。結(jié)論:1.尼可地爾可以通過上調(diào)NO水平,降低炎癥反應(yīng),改善HHcy對心梗后小鼠的微循環(huán)功能。2.尼可地爾通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路,從而發(fā)揮對缺血缺氧的保護的作用,從而改善內(nèi)皮細胞功能。
【圖文】：

小動物結(jié)扎血管前后心電圖變化

未見明顯異常顏色區(qū)域（圖3）；模型組：心肌組織切片大部分區(qū)域呈磚紅色，但均出現(xiàn)不同程度灰白色區(qū)域，出現(xiàn)部位在前室間隔偏左室處，與前降支血流供應(yīng)區(qū)域相符，提示前降支梗死，大鼠前降支近段缺血模型建立成功。圖 3：TTC 染色心臟不同切面的圖形 (n=3)4.4 心功能測定心梗后 14 天行心臟超聲檢查示（表 1）：四組小鼠的心功能和 sham 組相比較明顯下降，室壁運動減弱，心腔擴大，室壁厚度明顯減少。而 HHcy+MI 的小鼠比 MI 組小鼠心功能相關(guān)指標要更差。LVEF 結(jié)果顯示：與 Sham 組比較，其他各組的 LVEF 均明顯降低（P＜0.05);Vehicle 組與 HHcy+MI 組組間比較無顯著性差異（P>0.05）；但 HHcy+MI組與 MI 組相比明顯下降(P＜0.05），葉酸組可改善 HHcy+MI 組的 LVEF 水平。LVFS 結(jié)果顯示：與 Sham 組比較，，其他各組的 LVFS 均明顯降低（P＜0.05)；Vehicle 組與 HHcy+MI 組之間比較無差異（P>0.05），HHcy+MI 組 LVFS 水平與 MI 組相比明顯下降(P＜0.05），葉酸組治療后 LVFS 也是明顯升高（P＜0.05)。得到的各組趨勢與 LVEF—致。LVIDd 結(jié)果顯示：與 Sham 組相比較
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 殷培明;張愛元;;尼可地爾對比阿托伐他汀治療冠狀動脈慢血流的臨床效果觀察[J];濰坊醫(yī)學院學報;2015年05期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 林叢;高同型半胱氨酸血癥對冠狀動脈微循環(huán)能的影響[D];山東大學;2017年

本文編號：2663798