【摘要】：糖尿病動(dòng)脈硬化是多種心腦血管疾病——冠心病、腦卒中以及周?chē)芗膊〉墓餐±砘A(chǔ)。血管外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblasts,AFs)是血管外膜最豐富的細(xì)胞類(lèi)型,糖尿病狀態(tài)下,其發(fā)生表型改變和增殖、遷移能力增強(qiáng),膠原分泌增加,是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化主要病理機(jī)制之一。AGEs是蛋白質(zhì)、脂蛋白或者核酸等大分子在非酶催化、自發(fā)的與葡萄糖或其他還原性單糖反應(yīng)所形成的穩(wěn)定的共價(jià)生成產(chǎn)物,是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要中間物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期慢性高糖狀態(tài)下,AGEs生成增加,通過(guò)多種途徑促進(jìn)糖尿病心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。活化素受體樣激酶-7(Activin receptor-like kinase 7,ALK7)是從人胎盤(pán)克隆出的Activin受體家族新成員,也是TGF-β超家族I型受體之一,近年研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)多種途徑參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠ALK7下調(diào)后,動(dòng)脈纖維化程度得到明顯改善,并且ALK7與糖尿病的發(fā)生發(fā)展以及糖尿病心室重構(gòu),與糖尿病心肌纖維化關(guān)系密切。因此,本研究提出以下假說(shuō):糖尿病狀態(tài)下,AGEs通過(guò)ALK7信號(hào)通路調(diào)節(jié)AFs的增殖、遷移、膠原分泌,引起血管外膜膠原沉積,管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終導(dǎo)致動(dòng)脈硬化。目的:1.觀察AGEs對(duì)血管外膜成纖維細(xì)胞活化的影響;2.探討ALK7在AGEs誘導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞活化中的作用及可能機(jī)制;方法:1.體外培養(yǎng)SD大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞,給與AGEs刺激,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,檢測(cè)血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖活力、遷移能力、表型轉(zhuǎn)換及I型、III型膠原蛋白表達(dá)水平;2.AGEs刺激血管外膜成纖維細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組及BSA組,觀察ALK7蛋白的表達(dá)水平;3.構(gòu)建ALK7 siRNA質(zhì)粒,感染血管外膜成纖維細(xì)胞以抑制其ALK7的表達(dá),給與AGEs刺激后,觀察細(xì)胞增殖活力、表型轉(zhuǎn)換及I型、III型膠原蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.血管外膜成纖維細(xì)胞原代形態(tài)學(xué)觀察及免疫學(xué)鑒定結(jié)果;細(xì)胞呈扁平梭型,細(xì)胞核較大,約1-2個(gè),細(xì)胞質(zhì)透明;免疫標(biāo)記物鑒定vimentin綠色熒光陽(yáng)性,α-SMA紅色熒光為陰性,證實(shí)為血管外膜成纖維細(xì)胞。2.AGEs促進(jìn)AFs細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)換及Collagen I/III的分泌;AGEs刺激血管外膜成纖維細(xì)胞48h,與對(duì)照組比較,細(xì)胞增殖活力增加(P0.05),BSA組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異;AGEs刺激血管外膜成纖維細(xì)胞48h,與對(duì)照組比較,α-SMA表達(dá)增加(P0.05),BSA組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異;與對(duì)照組相比,Collagen I/III分泌增加(P0.05),BSA組與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。3.AGEs可以促進(jìn)ALK7的表達(dá);Western blotting結(jié)果證實(shí)ALK7在原代大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)。分別以低糖DMEM培養(yǎng)基和低糖DMEM培養(yǎng)基+BSA和低糖DMEM培養(yǎng)基+AGEs孵育血管外膜成纖維細(xì)胞0h、4h、8h、12h、24h、48h,結(jié)果顯示,AGEs刺激8h~48h,ALK7的表達(dá)水平較CON組顯著增加(P0.05),且成時(shí)間依賴(lài)性,48h稍下降,但增加差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BSA組與CON組相比較無(wú)明顯差異。4.ALK7參與調(diào)控AGEs誘導(dǎo)的AFs細(xì)胞增殖遷移、表型轉(zhuǎn)換、Collagen I/III分泌增加;采用ALK-siRNA抑制血管外膜成纖維細(xì)胞ALK7的表達(dá)后,AGEs刺激成纖維細(xì)胞48h后,與AGE組相比較,成纖維細(xì)胞增殖能力下降(P0.05),劃痕實(shí)驗(yàn)顯示下調(diào)ALK7后,與AGE組相比,血管外膜成纖維細(xì)胞遷移能力明顯降低(P0.05);α-SMA表達(dá)水平明顯下降(P0.01),I/III型膠原表達(dá)水平明顯減少(P0.05)。結(jié)論:1.AGEs可促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖遷移、表型轉(zhuǎn)換及Collagen I/III的表達(dá);2.AGEs可促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞ALK7蛋白的表達(dá);3.ALK7參與調(diào)控AGEs誘導(dǎo)的AFs細(xì)胞增殖遷移、表型轉(zhuǎn)換以及Collagen I/III的表達(dá)增加;
【圖文】：

細(xì)胞增殖活力的影響EM，CON 組)、牛血清白蛋白組（低糖 DMEM化終末產(chǎn)物組（低糖 DMEM+AGEs 200ug/ml，胞 48h，經(jīng) CCK-8 方法檢測(cè)結(jié)果為：糖基化終末和牛血清白蛋白組，晚期糖基化終末產(chǎn)物組增統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。胞的鑒定（400×）。A，相差顯微鏡下血管外膜成纖成纖維細(xì)胞的免疫學(xué)特征。藍(lán)色：細(xì)胞核（DAPI）；

結(jié)果結(jié)果1. 血管外膜成纖維細(xì)胞的鑒定倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞（圖 1A），，細(xì)胞呈扁平梭型，細(xì)胞核較大，1-2 個(gè)，細(xì)胞質(zhì)透明；細(xì)胞免疫熒光染色后可觀察到（圖 1B）：Vimentin（綠色熒光）為陽(yáng)性，α-SMA（紅色熒光）為陰性，DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核呈藍(lán)色，以上細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)特征證實(shí)該細(xì)胞為血管外膜成纖維細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R543.5

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本文編號(hào)：2661392