【摘要】：背景:臨床病人在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)期間出現(xiàn)高血糖(hyperglycemia,HG)的情況越來越常見,目前關(guān)于HG是否加重MI損傷的程度是有爭議的。大多數(shù)研究認為,無論入院前是否患有糖尿病(diabetes mellitus,DM),AMI患者出現(xiàn)HG與死亡率增加或預后更差相關(guān);但也有研究報道,HG在某些條件下對心肌缺血引起的心肌損傷具有保護作用。TNNI3K(troponin I interacting kinase)是新發(fā)現(xiàn)的MAPKKK家族的一種激酶,在心臟內(nèi)特異性表達,并與心肌肌鈣蛋白I特異性的結(jié)合。研究表明TNNI3K能促進心肌生成,增強心臟功能,并通過抑制p38/JNK介導的細胞凋亡來保護心肌免受缺血性損傷。TNNI3K也與心臟缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷有關(guān)。在治療缺血性心臟疾病的藥物研究中,目前已經(jīng)有針對TNNI3K作為標靶藥物的報道;但在缺血性心臟病合并HG的臨床病例或疾病模型中,尚無任何涉及TNNI3K的研究報道。目的:1.研究小鼠MI/R損傷后梗死周圍區(qū)的心肌表達TNNI3K與SCF或者SDF-1之間的聯(lián)系;2.研究HG對小鼠MI/R損傷后梗死周圍區(qū)的心肌表達TNNI3K、SCF和SDF-1的影響及其可能的相關(guān)機制。方法:體內(nèi)實驗:1.用正常成年C57小鼠構(gòu)建MI/R損傷模型,分別設(shè)置sham(假手術(shù))組、MI/R損傷后的第3、5和7天組。造模術(shù)中血管顯微鏡下直視,并用HE染色和Evans blue+TTC雙染色鑒定MI/R造模是否成功。用多種方法檢測各組的梗死周圍區(qū)的心肌組織表達TNNI3K、SCF和SDF-1的變化趨勢,并選取其中一個合適時間作為后續(xù)與HG組對照的MI/R時間點。2.用STZ誘導C57小鼠HG模型,然后分別制作正常糖(NG)和高血糖(HG)組小鼠的MI/R損傷模型,取MI/R損傷后第5天的心臟,用免疫組織化學方法檢測各組梗死周圍區(qū)心肌組織內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1蛋白的表達及定位。用ELISA檢測各組心肌組織表達SCF和SDF-1分泌型蛋白的情況;用Western blot檢測各組心肌組織內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1總蛋白的表達以及AKT和p38的磷酸化情況,并觀察三者之間的聯(lián)系;用RT-qPCR檢測各組心肌組織內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA水平的表達。體外實驗:分離培養(yǎng)C57乳鼠的原代心肌細胞24-48h,待細胞狀態(tài)較好(活性好和數(shù)量足夠)時,先換不同糖濃度(5.5、25和33mmol/L)和相應(yīng)的高滲對照組的培養(yǎng)基,常氧培養(yǎng)12h后,再行缺氧復氧(A/R)處理。用Western blot檢測各組心肌細胞內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1總蛋白以及AKT和p38的磷酸化的表達情況,并選取其中一個合適的高糖濃度作為后續(xù)實驗的HG組;ELISA檢測各組心肌細胞內(nèi)SCF和SDF-1分泌蛋白的表達,RT-qPCR檢測各組心肌細胞內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA的表達情況。結(jié)果:1.STZ誘導的HG組小鼠的血糖濃度達到23.66±0.81mmol/L,而control組的血糖值為6.81±0.15mmol/L,兩組間有顯著性差異(P0.05,n60)。2.HE染色和Evans blue+TTC雙染色顯示按照本實驗方法制作出的小鼠MI/R模型可靠。3.在NG組中,與sham組相比,MI/R組的梗死周圍區(qū)心肌組織表達TNNI3K、SCF和SDF-1蛋白和mRNA主要在第5天均明顯升高(P0.05,n10);NG和HG的sham組梗死周圍區(qū)表達三者的蛋白和mRNA的差別均不明顯(P0.05,n10);NG和HG的MI/R組梗死周圍區(qū)心肌組織表達TNNI3K、SCF和SDF-1三者的蛋白和mRNA均較各自的sham組明顯升高(P0.05,n10),而HG的MI/R組三者的蛋白和mRNA表達均低于NG組(P0.05,n10)。4.HG組(糖濃度33mmol/L)的心肌細胞內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA和蛋白的表達比LG組和相應(yīng)的高滲對照組均明顯降低(P0.05,n10)。5.Western blot檢測顯示:HG的MI/R組心肌組織內(nèi)表達P-AKT/AKT和P-p38/p38比NG的MI/R組均明顯降低(P0.05,n10);同時HG組(糖濃度33mmol/L)的心肌細胞內(nèi)表達P-AKT/AKT和P-p38/p38比LG組和相應(yīng)的高滲對照組均明顯降低(P0.05,n10)。結(jié)論:1.在NG組MI/R損傷模型中,梗死周圍區(qū)心肌組織內(nèi)TNNI3K的表達與SCF和SDF-1的表達同步升高,且三者的表達主要在MI/R損傷后的第5天明顯升高。2.HG減弱了MI/R損傷后心肌組織內(nèi)和A/R處理后的心肌細胞內(nèi)TNNI3K、SCF和SDF-1表達水平的升高,這可能是通過抑制AKT和p38 MAPK通路的磷酸化來實現(xiàn)。
【圖文】：

圖 1 實驗小鼠的血糖濃度2、鑒定小鼠 MI/R 模型分別取各組梗死周圍區(qū)的心臟組織，Hsham 組相比，NG 和 HG 的 MI/R 損傷后第面積約 40%左右，，說明本實驗模型成功。EEvans blue 藍染區(qū)是非梗死區(qū)的心肌組織；TTTC 染色陰性的蒼白區(qū)是完全梗死無活性驗方法可以成功構(gòu)建小鼠的 MI/R 損傷模型150 例以上，成功率達 75%。

圖 2 A、 HE staining B、 Evans blue+ TTC 雙染色A、各組梗死區(qū)及其周圍區(qū)心肌組織的 HE 染色結(jié)果，圖中箭頭所指即為梗死區(qū)。B、Evans blue+ TTC 雙染色結(jié)果，藍染區(qū)是非梗死區(qū)的心肌組織；紅染區(qū)是有活性的梗死區(qū)心肌組織，蒼白區(qū)是完全梗死無活性的心肌組織（即真正的梗死區(qū)）。3. 免疫組化檢測 TNNI3K、SCF 和 SDF-1 在 MI/R 損傷后的心肌組織內(nèi)的表達及定位免疫組織化學法檢測 NG 和 HG 的小鼠 sham 組和 MI/R 損傷術(shù)后第 5天組的梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)的心肌組織，100×鏡下可見結(jié)果如圖 3 所示：NG 和 HG 的 MI/R組梗周的心肌組織表達 TNNI3K、SCF 和 SDF-1 三者的蛋白均較各自的 sham 組明顯升高，而梗死區(qū)幾乎都不表達，但 HG比 NG 的 sham組和 MI/R 組梗死周圍區(qū)的心肌組織表達 TNNI3K、SCF和 SDF-1蛋白均明顯降低。另外 400×鏡下可見：TNNI3K
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22

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本文編號：2661001