【摘要】：目的:c-kit陽性心臟干細(xì)胞是能促進(jìn)心血管疾病患者恢復(fù)心功能的重要干細(xì)胞移植來源之一。但是其移植后的生存能力受多方面的的制約而受到挑戰(zhàn)。已有研究證明IGF-1促進(jìn)移植后心臟干細(xì)胞的存活能力從而提高心功能,但具體機(jī)制尚不明確。本研究旨在闡明IGF-1對(duì)心臟干細(xì)胞的增殖遷移能力的影響及其具體機(jī)制。方法:第一部分:無菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟,結(jié)合組織塊培養(yǎng)法,酶消化法獲得心臟干細(xì)胞后再經(jīng)免疫磁珠篩選法進(jìn)行純化。用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),流式細(xì)胞儀分析所得細(xì)胞表面標(biāo)記c-kit、Scal-1、CD34、CD45的表達(dá)。第二部分:將獲取的c-kit心臟干細(xì)胞分為兩組:分別未經(jīng)IGF-1的干預(yù)和100ng/ml的IGF-1干預(yù)72小時(shí)。用CCK-8增殖試劑盒和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組c-kit心臟干細(xì)胞的增殖遷移能力。用western blotting和q-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞c-kit的蛋白及m RNA表達(dá)變化及PI3K/AKT信號(hào)通路的介導(dǎo)情況。并用該信號(hào)通路抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述猜想。第三部分:采用循環(huán)比色法檢測(cè)經(jīng)IGF-1干預(yù)前后,細(xì)胞DNMTs活性變化。采用western blotting檢測(cè)c-kit心臟干細(xì)胞經(jīng)IGF-1處理后p-Akt、DNMTs(包括DNMT1,DNMT3α,DNMT3β)和c-kit蛋白表達(dá)變化;采用q-PCR檢測(cè)DNMTs、c-kit的m RNA表達(dá)水平改變。并用LY294002逆轉(zhuǎn)上述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。亞硫酸氫鹽測(cè)序法BSP檢測(cè)DNMTs對(duì)c-kit啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的影響。第四部分:采用q-PCR檢測(cè)IGF-1干預(yù)后mi R-193a表達(dá)變化。熒光素酶檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)mi R-193a與c-kit基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況。慢病毒轉(zhuǎn)染c-kit陽性心臟干細(xì)胞過表達(dá)mi R-193a后,分別用western blotting和q-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞ckit的蛋白和m RNA表達(dá)變化,CCK-8增殖試劑盒和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組c-kit干細(xì)胞的增殖遷移能力。結(jié)果:第一部分:在相差倒置顯微鏡下觀察,可見磁珠篩選后的細(xì)胞呈克隆樣擴(kuò)增。流式細(xì)胞學(xué)分析顯示磁珠篩選后的表面標(biāo)記c-kit陽性CSCs表面標(biāo)記c-kit陽性率87.42%,Scal-1陽性率為55.97%,而CD34陽性率為1.04%,CD45陽性率為0.95%。第二部分:在IGF-1干預(yù)后,c-kit陽性心臟干細(xì)胞的增殖遷移能力較空白組均有所提高。Western blotting檢測(cè)IGF-1干預(yù)后,p-akt和c-kit蛋白表達(dá)上均有所提高。采用LY294002逆轉(zhuǎn)后,c-kit蛋白水平及m RNA水平表達(dá)及細(xì)胞的增殖遷移能力均受到抑制。第三部分:循環(huán)比色法檢測(cè)IGF-1組的總DNMT,DNMT1,DNMT3β活性較空白組有所增加,而DNMT3α活性沒有明顯改變。Western blotting檢測(cè)IGF-1干預(yù)后,DNMT1,DNMT3β蛋白表達(dá)水平增加,上述效應(yīng)可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑逆轉(zhuǎn)。BSP檢測(cè)c-kit啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平結(jié)果顯示,IGF-1組與空白組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。第四部分:q-PCR檢測(cè)mi R-193a在IGF-1干預(yù)組表達(dá)含量較空白組明顯下降,該趨勢(shì)可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑及甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza所逆轉(zhuǎn)。BSP檢測(cè)mi R-193a基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平結(jié)果顯示,IGF-1組明顯高于空白組,該現(xiàn)象可被甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑所逆轉(zhuǎn)。同時(shí)熒光素酶結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,mi R-193a可調(diào)控c-kit基因表達(dá)。同時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒,使之過表達(dá)mi R-193a,western blotting及q-PCR檢測(cè)c-kit在蛋白水平和m RNA水平都被抑制,細(xì)胞的增殖遷移能力也受到抑制。結(jié)論:IGF-1促進(jìn)c-kit陽性干細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制,是激活PI3K/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)DNMTs的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mi R-193a基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度增加,抑制mi R-193a的表達(dá),從而促進(jìn)c-kit蛋白表達(dá)增加,最終提高c-kit陽性干細(xì)胞遷移和增殖能力。目的:本文設(shè)計(jì)了一種新型的,帶有分級(jí)孔結(jié)構(gòu)的3D介孔二氧化硅材料,并將其作為IGF-1這種藥物釋放的載體,同時(shí)3D細(xì)胞支架可促進(jìn)c-kit陽性心臟干細(xì)胞遷移與增殖。方法:3D細(xì)胞支架的分級(jí)孔結(jié)構(gòu)可通過SEM、TEM、XRD以及氮?dú)馕摳角�進(jìn)行表征。ELISA檢測(cè)該材料吸附及釋放IGF-1的定量分析。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用DNA定量檢測(cè)試劑盒及transwell遷移實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用小鼠心梗模型及心梗區(qū)域注射該材料負(fù)載IGF-1和c-kit陽性心臟干細(xì)胞,小鼠心臟超聲檢測(cè)左心射血分?jǐn)?shù)及心功能的變化。結(jié)果:我們制作出了新型帶有分級(jí)孔結(jié)構(gòu)的3D介孔二氧化硅材料,該材料對(duì)IGF-1的吸收量可達(dá)到12μg g-1,并且,藥物的釋放可持續(xù)至少250個(gè)小時(shí)。同時(shí),IGF-1支架促進(jìn)c-kit陽性心臟干細(xì)胞的增殖及遷移的作用則通過DNA定量分析測(cè)試以及Transwell測(cè)試得出。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該介孔材料負(fù)載IGF-1和c-kit陽性心臟干細(xì)胞相較于單獨(dú)c-kit陽性心臟干細(xì)胞植入組更有利于心梗后小鼠心功能的恢復(fù)。結(jié)論:我們探索出新方法,制作出新型材料,拓展3D細(xì)胞支架的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,同時(shí)實(shí)現(xiàn)生長因子的緩釋以及高效的細(xì)胞增殖遷移率,在體內(nèi)促進(jìn)小鼠受損心臟的恢復(fù)。
【圖文】：

大部分的miRNAs來源于基因間隔序列，即基因組中的非編碼序列，，多以基因簇的形式分布，其他miRNAs基因位于基因內(nèi)含子區(qū)域。圖1： miRNAs分子生物合成過程示意圖成熟的 miRNAs 分子的生物形成過程包含如下幾個(gè)步驟（如圖 1 所示）: 在RNA 聚合酶 II/III 的作用下，將 microRNA 基因轉(zhuǎn)錄合成為 microRNA 前體(pre-microRNA),pre-microRNA 是具有 5′端的帽子、3′端的 polyA 尾的結(jié)構(gòu)特征的

圖 1-2 約 2 周后從心肌組織塊遷移出來的“小、圓、亮胞儀表面標(biāo)記的鑒定磁珠分選后的擴(kuò)增后的心臟干細(xì)胞，為鑒定其表面標(biāo)-1、CD34、CD45 抗體，使用表面標(biāo)記流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)結(jié)果如圖 2-1 所示：CSCs 表面標(biāo)記 c-kit 陽性率 87.%，而 CD34 陽性率為 1.04%，CD45 陽性率為 0.95%高的 c-kit 陽性心臟干細(xì)胞，同時(shí)使用其他常用的表干細(xì)胞的來源，以確保本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞需求
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R54

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 羅勁勇;萬書平;;早發(fā)冠心病并阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者外周血IGF-1和IL-18的表達(dá)研究[J];華南國防醫(yī)學(xué)雜志;2016年12期

2 胡菁;楊貴麗;顧麗萍;;羥苯磺酸鈣膠囊治療老年糖尿病視網(wǎng)膜病變的療效及其對(duì)VEGF、IGF-1水平的影響[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);2017年05期

3 劉標(biāo);易鳴;張依裕;王振;程朝友;楊德文;程均華;付正仙;王進(jìn);;威寧綿羊IGF-1基因外顯子多態(tài)性分析[J];山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào);2017年02期

4 張曉昀;曹明芳;;IGF-1與糖尿病性視網(wǎng)膜病變的相關(guān)關(guān)系[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2017年05期

5 庾更緒;王晉;;海昆腎喜膠囊治療糖尿病腎病的臨床觀察及對(duì)血清中IGF-1的影響[J];中國醫(yī)藥指南;2016年22期

6 王玉玨;田雨光;顧為望;岳敏;;西藏小型豬IGF-1基因的克隆測(cè)序分析[J];中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2015年01期

7 王爽;李娜;穆亞平;;早產(chǎn)兒血清IGF-1水平與喂養(yǎng)困難的相關(guān)性研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2015年07期

8 王永會(huì);張軍玲;;肌萎縮側(cè)索硬化患者血清和腦脊液中IGF-1水平相關(guān)性研究[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2014年11期

9 徐鴻美;卜曙e

本文編號(hào)：2660864