【摘要】：研究背景:本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重?zé)齻笤缙谛募〖匆寻l(fā)生缺血缺氧損害。細(xì)胞實驗結(jié)果提示,微管相關(guān)蛋白4(microtubule associated protein 4,MAP4)磷酸化增高是引起心肌細(xì)胞缺血缺氧損害的重要機制。但是在臨床患者和在體動物中,MAP4持續(xù)磷酸化增高會對心臟產(chǎn)生何種病理生理影響我們尚不明確。因此,探究MAP4持續(xù)磷酸化的病理生理意義有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識嚴(yán)重?zé)齻笮募∪毖毖鯎p害的可能機制,并為臨床防治心肌缺血缺氧損害提供重要靶點和方向。作為調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動力學(xué)的重要分子,微管相關(guān)蛋白家族(microtubule associated proteins,MAPs)具有與微管(microtubule,MT)結(jié)合并促進(jìn)其聚合的特性,當(dāng)MAPs磷酸化增加時,其活性下降,導(dǎo)致微管解聚。常見的三種MAPs包含MAP4,MAP2和tau,這其中僅有MAP4廣泛表達(dá)于非神經(jīng)元細(xì)胞,而MAP2和tau多表達(dá)于神經(jīng)元組織中。既往大量研究表明,位于人源性微管結(jié)合域內(nèi)的脯氨酸富集區(qū)域的絲氨酸696、768和787位點磷酸化水平的改變,對于調(diào)節(jié)微管動力學(xué)有著重要意義,而且絲裂原活化蛋白激酶激酶6/p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)/(p38 mitogen-activated protein kinase,p38/MAPK)是介導(dǎo)缺氧條件下MAP4磷酸化增高和微管解聚的重要上游激酶。除了微管動力學(xué)改變,本課題組前期的體外實驗還證明了MAP4磷酸化對于心肌細(xì)胞線粒體途徑凋亡具有重要作用:MAP4磷酸化后與微管蛋白結(jié)合力下降,從微管蛋白上脫落后轉(zhuǎn)位到線粒體上,繼而引起線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的開放和細(xì)胞色素c的釋放,從而啟動線粒體凋亡的發(fā)生。盡管如此,當(dāng)MAP4持續(xù)磷酸化時,微管動力學(xué)和線粒體的變化會在在體動物中引起何種改變,以及產(chǎn)生的臨床效應(yīng)如何,均有待進(jìn)一步探索。因此,本研究通過觀察缺氧和壓力負(fù)荷心臟疾病動物模型心肌組織,以及法洛四聯(lián)癥患者心肌標(biāo)本中MAP4磷酸化的改變,了解其在心臟疾病中的普遍意義;繼而通過構(gòu)建MAP4定點突變的基因敲入小鼠模擬MAP4持續(xù)磷酸化,探索其在在體動物上可能導(dǎo)致的病理生理效應(yīng)及其具體機制,旨在深入揭示臨床相關(guān)疾病發(fā)生機制,并為其治療提供新的方向和靶點。材料和方法:1.從新橋醫(yī)院心外科收集16例經(jīng)手術(shù)治療的法洛四聯(lián)癥(tetralogy of fallot,TOF)患者的肥厚心臟右心室標(biāo)本(約100 mg),并根據(jù)患者動脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation,SaO_2)分為兩組(SaO_290%和SaO_2≥90%,各8例);構(gòu)建心肌梗塞(myocardial infarction,MI)和主動脈縮窄(transverse aortic constriction,TAC)小鼠動物模型,分別獲得其左心室心肌標(biāo)本;通過免疫印跡對所獲得的三種心肌病理標(biāo)本進(jìn)行檢測,了解MAP4(S696,S768,S787)(對應(yīng)小鼠位點為S667,S737,S760)和p38/MAPK磷酸化水平在不同類型心臟疾病中的變化情況。2.委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司通過基因編輯技術(shù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9,CRISPR/Cas9)構(gòu)建MAP4(S667A,S737E,S760E)基因敲入小鼠(MAP4 KI),并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)對小鼠進(jìn)行鑒定。分別對10-14、30-34和70-74周齡的野生型(wild type,WT)和MAP4 KI小鼠進(jìn)行觀察檢測,通過超聲心動圖、無創(chuàng)血壓、試劑盒、免疫印跡、免疫熒光、病理切片染色、透射電鏡、大體檢測、免疫組化等多種方法和手段了解MAP4磷酸化對心臟形態(tài)、功能和病理變化的影響。同時,我們通過構(gòu)建模擬MAP4(S768A和S787A)去磷酸化突變體(MAP4(alanine,Ala(A)))轉(zhuǎn)染W(wǎng)T和MAP4 KI原代小鼠乳鼠心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞,干預(yù)異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)(20μM)介導(dǎo)的體外病理性心臟重塑模型,進(jìn)一步明確MAP4磷酸化在病理性心臟重塑中的作用。3.通過收集10-14和70-74周齡的WT和MAP4 KI小鼠的左心室心臟組織,利用原位末端凋亡法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)試劑盒、病理切片染色、免疫印跡和透射電鏡觀察心肌細(xì)胞凋亡、壞死和壞死性凋亡、線粒體凋亡關(guān)鍵酶和線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷情況,通過分離提取小鼠心臟組織線粒體和非線粒體樣本,利用免疫印跡法檢測線粒體細(xì)胞色素c的釋放情況;然后利用病理切染色、透射電鏡和TUNEL組化染色法對TOF患者的右心室心臟標(biāo)本進(jìn)行檢測,明確TOF患者心臟標(biāo)本中心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷情況;此外,利用MAP4(Ala)轉(zhuǎn)染原代小鼠乳鼠心肌細(xì)胞,以ISO刺激48小時,通過免疫熒光共染、免疫印跡和透射電鏡對心肌細(xì)胞凋亡、線粒體凋亡關(guān)鍵酶和線粒體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測,同時分離提取原代小鼠乳鼠心肌細(xì)胞線粒體和非線粒體成份,利用免疫印跡法檢測原代心肌細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素c的釋放情況,以此明確MAP4磷酸化對心肌細(xì)胞凋亡的影響。4.收集10-14和70-74周齡的WT和MAP4 KI小鼠心臟標(biāo)本,分別提取游離態(tài)和聚合態(tài)微管蛋白、線粒體和非線粒體成份以及細(xì)胞總蛋白,通過免疫印跡和免疫共沉淀法對MAP4與微管蛋白之間的相互作用、游離態(tài)和聚合態(tài)微管蛋白表達(dá)情況以及MAP4線粒體磷酸化轉(zhuǎn)位情況進(jìn)行檢測;同時,體外培養(yǎng)WT和MAP4 KI原代小鼠乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,分離獲取細(xì)胞總蛋白、線粒體和非線粒體蛋白、聚合態(tài)和游離態(tài)微管蛋白,通過轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)、p38/MAPK抑制劑SB203580(5μM)或MKK6(谷氨酸(glutamic acid),Glu(E))預(yù)處理細(xì)胞,以ISO刺激細(xì)胞48小時,然后利用免疫印跡、免疫熒光、透射電鏡對細(xì)胞微管蛋白的結(jié)構(gòu)和含量、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞肥大和纖維化、細(xì)胞線粒體損傷以及線粒體細(xì)胞色素c釋放情況分別進(jìn)行檢測,以此明確MAP4磷酸化介導(dǎo)病理性心臟重塑的可能機制。結(jié)果:1.通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),SaO_290%較SaO_2≥90%的TOF心臟標(biāo)本提示,MAP4(S768和S787)磷酸化在缺氧組明顯增加,而MAP4(S696)磷酸化和MAP4表達(dá)無顯著差異;在MI小鼠模型中,血管結(jié)扎60、180和360 min后,MAP4(S667,S737,S760)磷酸化均較假手術(shù)組明顯增高,而結(jié)扎5 min后未見明顯差異,同時p38/MAPK的激活和MAP4磷酸化的變化趨勢一致;而對于TAC小鼠模型,手術(shù)后3周獲得左心室心臟標(biāo)本,檢測發(fā)現(xiàn)MAP4(S737和S760)磷酸化較假手術(shù)組明顯增高,而MAP4(S667)磷酸化和MAP4表達(dá)較假手術(shù)組無顯著差異,不僅如此,p38/MAPK在TAC手術(shù)后3周也較假手術(shù)組明顯激活。2.首先我們成功構(gòu)建并鑒定MAP4 KI小鼠,以同窩小鼠進(jìn)行實驗。通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),WT與MAP4 KI在正常狀態(tài)下,MAP4(S667)磷酸化水平無明顯差異,且表達(dá)量均很低,而MAP4 KI小鼠較WT小鼠的心臟MAP4(S737和S760)顯著增高,提示模型構(gòu)建成功。然后對10-14、30-34和70-74周齡的WT和MAP4 KI小鼠進(jìn)行心臟肥大指標(biāo)的觀察檢測,發(fā)現(xiàn)MAP4 KI小鼠在30-34周和70-74周時,心臟重量(heart weight,HW)、心臟重量/體重(heart weight/body weight,HW/BW)和心臟重量/脛骨長度(heart weight/tibia length,HW/TL)分別較對照組小鼠增加22%、19%和23%,心臟大體可見左心室游離壁和室間隔明顯增厚;在體心功能提示,MAP4 KI小鼠較WT小鼠表現(xiàn)為年齡依賴性的心臟舒縮功能減退,且舒張功能異常早于收縮功能異常;而且心肌細(xì)胞橫截面面積、心臟肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和肌球蛋白重鏈7(myosin heavy chain 7,MYH7)也明顯增高,肌小節(jié)超微結(jié)構(gòu)可見肌絲溶解和稀疏,呈現(xiàn)年齡依賴性的破壞加重,而在10-14周時,WT與MAP4 KI小鼠在上述指標(biāo)方面無顯著差異。此外,WT與MAP4 KI小鼠血壓在各年齡段均無顯著差異。而對于心臟纖維化指標(biāo),在30-34周時,MAP4 KI小鼠較WT小鼠表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞旁膠原沉積、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和平滑肌肌動蛋白增加,而大體膠原染色則僅在70-74周時才出現(xiàn)顯著增加,在10-14周時,上述指標(biāo)在WT和MAP4 KI小鼠之間無明顯差異。在細(xì)胞實驗中,我們通過轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)抑制MAP4磷酸化,同時用ISO刺激原代小鼠乳鼠心肌或成纖維細(xì)胞,繼而誘導(dǎo)心肌肥大和纖維化,結(jié)果提示,ISO能夠誘導(dǎo)心肌肥大和纖維化的發(fā)生,且MAP4 KI較WT原代細(xì)胞更為明顯,而轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)能夠有效抑制ISO誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)分泌,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、MYH7和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的表達(dá)降低和心肌細(xì)胞橫截面面積減小,以及成纖維細(xì)胞分泌的I型膠原、III型膠原、纖維連接蛋白和平滑肌肌動蛋白表達(dá)減少,且這種改變在WT原代細(xì)胞中較MAP4 KI原代細(xì)胞中抑制的更為明顯。3.我們獲得10-14和70-74周齡的WT和MAP4 KI小鼠的心臟組織標(biāo)本并進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在10-14周齡時,MAP4 KI小鼠心臟中活化的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cleaved caspase-3)、線粒體細(xì)胞色素c的釋放、線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷和心肌細(xì)胞凋亡均較WT組明顯增加,而到70-74周時,這些破壞效應(yīng)更加明顯;而心肌組織壞死和壞死性凋亡的蛋白標(biāo)志物在各個年齡段均無顯著改變;而在TOF心臟標(biāo)本中,我們觀察到,缺氧組較常氧組心肌組織凋亡比例顯著增加;同樣地,我們通過體外培養(yǎng)WT和MAP4 KI小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞,并以ISO進(jìn)行刺激,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)能夠有效抑制ISO導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡和線粒體破壞增加,表現(xiàn)為cleaved caspase-3表達(dá)降低、細(xì)胞色素c釋放減少,以及TUNEL標(biāo)記的心肌凋亡陽性細(xì)胞減少和線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞減輕。4.通過對10-14和70-74周齡WT和MAP4 KI小鼠心臟標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn),10-14周時,MAP4 KI較WT小鼠已經(jīng)出現(xiàn)聚合態(tài)微管蛋白的減少和游離態(tài)微管蛋白的增加,而且MAP4發(fā)生線粒體磷酸化轉(zhuǎn)位增加。在體外實驗中,使用ISO處理原代小鼠乳鼠心肌或成纖維細(xì)胞,并應(yīng)用MAP4(Ala)和p38/MAPK抑制劑SB203580轉(zhuǎn)染或預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MAP4(Ala)和SB203580能夠有效抑制ISO導(dǎo)致的心肌細(xì)胞微管破壞、MAP4線粒體磷酸化轉(zhuǎn)位增加和線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞、心肌細(xì)胞凋亡增加和成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白增加,不僅如此,轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)還能夠抑制MKK6(Glu)激活p38/MAPK導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡增加、微管破壞和線粒體損害。結(jié)論:不論在缺氧和壓力負(fù)荷心臟疾病動物模型,還是法洛四聯(lián)癥患者,心肌組織中MAP4磷酸化水平都較對照組顯著增加。MAP4持續(xù)磷酸化導(dǎo)致病理性心臟重塑的發(fā)生發(fā)展,主要表現(xiàn)為心肌肥厚、纖維化、舒張和收縮功能下降。微管解聚、磷酸化MAP4線粒體轉(zhuǎn)位以及心肌細(xì)胞凋亡增加可能是介導(dǎo)MAP4磷酸化引起病理性心臟重塑的重要機制,p38/MAPK則是介導(dǎo)MAP4磷酸化的重要上游激酶。以上結(jié)果有助于我們進(jìn)一步深入認(rèn)識心肌細(xì)胞通過何種途徑感受缺血缺氧損害信號的這一科學(xué)問題,豐富了心臟缺血缺氧損害和心臟重塑發(fā)病機制的研究內(nèi)容,為相關(guān)疾病的干預(yù)和治療提供新靶點和方向。
【圖文】：

抗體驗證

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文2-2，c 和 d）；但是在 TAC 術(shù)后 3 周檢測左心室心肌標(biāo)本時發(fā)現(xiàn)，，僅有 MAP4（S737和 S760）磷酸化表達(dá)增加（n=6,***p<0.001vs.Sham 組，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示），而MAP4（S667）與對照組相比無明顯改變（n=6,p>0.05vs.Sham 組，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示）（圖 2-2，e 和 f）。因此，上述結(jié)果提示，MAP4（S737 和 S760）磷酸化在缺氧和肥大相關(guān)的心臟疾病中具有普遍意義。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541;R644

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