【摘要】：目的:心臟肥大是心臟對血流動力學(xué)改變的一種適應(yīng)性反應(yīng)。高血壓、瓣膜病等引起的心臟肥大是一種代償反應(yīng),早期心臟功能增加,伴有心臟胚胎基因再表達(dá),逐漸會發(fā)生間質(zhì)纖維化、細(xì)胞凋亡增加,心功能下降,最終心臟衰竭,稱為病理性心臟肥大。生理性心臟肥大是指后天的生長發(fā)育、妊娠、運(yùn)動訓(xùn)練引起的心臟肥大,其心臟結(jié)構(gòu)正常,無心臟胚胎基因再表達(dá)和間質(zhì)纖維化,心功能正�；蛟黾�,這種肥大是可逆性的、且一般不會進(jìn)展為心臟衰竭。microRNA是短鏈非編碼RNA,通過與靶基因3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA的表達(dá)。microRNAs參與許多生理和病理過程的調(diào)節(jié),關(guān)于microRNA與病理性心臟肥大的研究較多,但其與生理性心臟肥大的機(jī)制仍不十分清晰。本課題利用心臟特異過表達(dá)miR-223小鼠和miR-223過表達(dá)NRCM誘導(dǎo)心臟肥大,并進(jìn)行了機(jī)制研究,可為臨床治療心臟肥大提供理論基礎(chǔ)。方法:1.應(yīng)用踏板運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)生理性心臟肥大小鼠模型,通過RT-PCR檢測肥大心臟組織中miR-223表達(dá)水平。2.在α-MHC構(gòu)建心臟特異表達(dá)的miR-223過表達(dá)小鼠模型中,觀察HW/BW,進(jìn)行WGA染色、Masson染色測定細(xì)胞大小及纖維化程度,利用RT-PCR測定纖維化標(biāo)記物及心臟胚胎基因的表達(dá)水平,應(yīng)用心臟超聲檢測LVPWd、LVPWs、IVSd、IVSs、EF、FS等指標(biāo)。3.分離培養(yǎng)NRCM,構(gòu)建Ad.miR-223及Ad.GFP并轉(zhuǎn)染NRCM,通過免疫熒光染色觀察過表達(dá)miR-223的NRCM細(xì)胞形態(tài)及大小。4.利用RNAseq檢測miR-223 TG小鼠心臟中基因表達(dá)變化,并通過RT-PCR檢測TG小鼠心臟及miR-223過表達(dá)NRCM中部分基因表達(dá)變化。5.利用western blot檢測miR-223 TG小鼠心臟及miR-223過表達(dá)NRCM中Akt、磷酸化Akt等蛋白表達(dá)水平。6.通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FBXW7和Acvr2a是否為miR-223的靶基因。結(jié)果:1.4周踏車運(yùn)動后,運(yùn)動組小鼠表現(xiàn)為心臟肥大(運(yùn)動組HW/BW為5.02±0.52,對照組為HW/BW4.23±0.18),且肥大心臟組織中miR-223表達(dá)增加(2.047±0.069,n=4,p0.05)。2.通過ɑ-MHC啟動子建立心臟特異性過表達(dá)mi R-223小鼠模型,Line#6,Line#10和Line#15基因型鑒定為陽性,其中Line#6,Line#10成功傳代。與WT比較,Line#6和Line#10的miR-223表達(dá)分別增加1300倍和600倍。3.與WT小鼠比較,TG小鼠HW/BW明顯增加;WGA染色顯示,TG小鼠心肌細(xì)胞明顯增大;Masson染色顯示,TG小鼠心臟無纖維化;RT-PCR結(jié)果顯示,TG小鼠心臟纖維化基因標(biāo)記物(Col I,Col III和CTGF)和病理性心臟肥大標(biāo)記物(ANP,BNP,β-MHC和α-SKA)沒有變化;血壓測量結(jié)果顯示,TG小鼠血壓沒有變化;超聲結(jié)果,TG小鼠心臟IVSd、IVSs、EF、FS顯著增加;TG小鼠運(yùn)動持續(xù)時(shí)間明顯延長。4.分離培養(yǎng)的NRCM,與Ad.GFP轉(zhuǎn)染組比較,Ad.miR-223轉(zhuǎn)染后24小時(shí)miR-223表達(dá)增加3.4倍,但沒有對細(xì)胞大小產(chǎn)生影響;轉(zhuǎn)染后48小時(shí),miR-223增加71倍,而且細(xì)胞增大1.5倍。5.RNAseq結(jié)果顯示,與WT比較,miR-223 TG小鼠心臟中81個(gè)基因表達(dá)上調(diào),27個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。RT-PCR驗(yàn)證了其中11個(gè)基因,結(jié)果與RNAseq基本一致。與Ad.GFP轉(zhuǎn)染組比較,Ad.miR-223轉(zhuǎn)染后24小時(shí),NRCM中Postn和Rxfp1升高,Egln3降低,與TG心臟基因表達(dá)結(jié)果一致;轉(zhuǎn)染后48小時(shí),Atf3,Akip1,Ndrg4和Postn表達(dá)增加,而Egln3和Csq2表達(dá)降低,與TG心臟基因表達(dá)結(jié)果相似。6.Western blot結(jié)果顯示,與Ad.GFP轉(zhuǎn)染組比較,Ad.miR-223轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí),Thr308和Ser473兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化Akt水平均表達(dá)增高,且Akt磷酸化可被其特異性抑制劑MK2206抑制,同時(shí)細(xì)胞增大被抑制。7.熒光素酶報(bào)告顯示,ACVR2a和FBXW7的3’-UTR包含代表mi R-223靶點(diǎn)的結(jié)合模板,是miR-223的靶基因。8.Western blot結(jié)果顯示,miR-223過表達(dá)的NRCM和miR-223 TG小鼠心臟組織中ACVR2a、FBXW7及Egln3表達(dá)降低,Hif-1α和Postn的表達(dá)增加。結(jié)論:1.4周踏車運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)的生理性心臟肥大小鼠,心臟組織中miR-223表達(dá)增加。2.小鼠心臟及NRCM,miR-223過表達(dá)均可誘導(dǎo)生理性心肌肥大,且這種肥大是通過Akt磷酸化介導(dǎo)的。3.miR-223過表達(dá)通過FBXW7-Hif-1α-Postn和ACVR2a-Egln3-Hif-1α兩個(gè)信號通路誘導(dǎo)了生理性心臟肥大。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54

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本文編號：2660249