【摘要】：研究背景心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征,由于心臟結(jié)構(gòu)或功能的異常,損害了心臟的充盈或射血能力,導(dǎo)致心輸出量不能滿足機體組織代謝需要。常見的臨床癥狀包括呼吸困難、體力活動受限、體液潴留等。心力衰竭的病理生理機制復(fù)雜,心肌細胞凋亡在心力衰竭的形成及進展過程中起著重要的作用,抑制心肌細胞凋亡對于心力衰竭的防治具有積極的意義。磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)信號傳導(dǎo)通路參與哺乳動物心肌細胞凋亡的調(diào)控,其中AKT蛋白的活性在心力衰竭過程中變化復(fù)雜。有研究顯示,長期AKT蛋白活化可以引起心肌細胞的病理性肥大與心腔擴大,導(dǎo)致心臟收縮功能障礙,加速心力衰竭惡化。晚期心力衰竭病人AKT蛋白磷酸化升高,經(jīng)過左室輔助裝置治療后,AKT蛋白磷酸化顯著下降,心功能明顯改善。但是也有報道顯示AKT的短期活化可以抑制細胞凋亡因子、促進心肌細胞能量代謝及抑制炎癥反應(yīng),逆向改善心功能,對心力衰竭的患者有益。雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,近年來的研究發(fā)現(xiàn)其具有心臟保護作用。雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)壓力負荷增加引起的心肌肥厚和心臟擴大,改善心臟功能。也有研究表明,雷帕霉素作為mTOR抑制劑,不同劑量條件下對AKT蛋白活性影響不同。在低濃度條件下通過抑制mTORCl,可以增加AKT蛋白的活性,而在高濃度條件下,雷帕霉素則可以抑制AKT蛋白的活性,機制可能主要是通過mTORC2通路。然而,據(jù)我們調(diào)研,國內(nèi)外目前尚沒有大規(guī)模的研究關(guān)注雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細胞細胞凋亡的影響以及PI3K-AKT-mTOR通路的AKT蛋白在此進展過程中的作用。研究目的本實驗研究旨在評價不同劑量的雷帕霉素對心力衰竭大鼠心臟的干預(yù)效果,以超聲心動圖、BNP、心肌組織病理改變、心肌細胞凋亡指數(shù)及心肌組織AKT蛋白磷酸化等指標(biāo),探討雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細胞PI3K-AKT-mTOR信號通路中AKT蛋白活性變化及心肌細胞凋亡和心臟功能的影響,期待能夠為雷帕霉素對心肌細胞的保護作用和心力衰竭藥物治療的進展提供一些新的理論依據(jù)。研究方法65只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機選取10只作為假手術(shù)組(n=10,空白組)。其余采用腹主動脈縮窄術(shù)的方法建立大鼠心力衰竭模型,8周后將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組(n=10)、低劑量雷帕霉素+模型組(n=10,1mg/kg/d;低劑量組)、中劑量雷帕霉素+模型組(n=10,2.5 mg/kg/d;中劑量組)、高劑量雷帕霉素+模型組(n=10,4.5 mg/kg/d;高劑量組)。雷帕霉素通過尾靜脈注射,連續(xù)給藥四周。治療結(jié)束后,觀察大鼠的一般情況,應(yīng)用超聲心動圖評價大鼠的心臟功能,用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中B型腦鈉肽水平,HE染色觀察大鼠心肌組織的病理變化,TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡情況,Western Blot檢測大鼠心肌組織中PI3K-AKT-mTOR信號通路的關(guān)鍵蛋白AKT磷酸化的表達情況。明確不同劑量的雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細胞中AKT蛋白磷酸化表達及心肌細胞凋亡和心臟功能的影響。研究結(jié)果1.大鼠一般狀態(tài):空白組大鼠生長良好,一般狀態(tài)與生存質(zhì)量可;模型組大鼠逐漸出現(xiàn)心功能不全的癥狀與體征,一般狀態(tài)與生存質(zhì)量差。與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的逐漸增加,一般狀態(tài)改善以及生存質(zhì)量提高的程度均逐漸增加,以高劑量組大鼠改善與提高的程度最明顯。2.超聲心動圖檢查結(jié)果:與空白組比較,模型組室壁運動減弱,左室舒張末徑(LVIDd,mm)和左室收縮末徑(LVIDs,mm)明顯增加(p0.01),左室射血分數(shù)(LVEF,%)和左室短軸縮短率(LVFS,%)明顯減低(p0.01)。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,室壁運動逐漸增強,LVIDd、LVIDs數(shù)值逐漸降低,LVEF、LVFS數(shù)值逐漸增加(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,中、大劑量雷帕霉素給藥組的LVIDd、LVIDs值均減低,LVEF、LVFS均增加(p0.05,p0.01)。3.大鼠組織形態(tài)學(xué)變化:肉眼觀察心臟大體形態(tài)發(fā)現(xiàn),空白組大鼠心臟幾何形態(tài)完整,心腔大小正常,呈鮮紅色,彈性及韌性良好。模型組大鼠心臟失去原有的幾何形態(tài),心腔明顯擴大,呈暗紅色,彈性及韌性差。雷帕霉素+模型各組心腔均有不同程度擴大,但與模型組相比,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,心腔擴大程度逐漸減低,顏色呈暗紅色,彈性及韌性尚可。用HE染色觀察心肌組織病理改變,包括心肌細胞大小及水腫情況、心肌纖維結(jié)構(gòu)排列情況、細胞間質(zhì)改變等�？瞻捉M大鼠:心肌細胞排列整齊、心肌纖維呈平行排列且緊密,呈束狀,橫紋清晰可見,胞核清晰,心肌細胞形態(tài)大小正常。模型組大鼠:心肌細胞水腫、肥大,有大量空泡,其大小和形狀不同,心肌細胞形態(tài)各異。心肌纖維斷裂、排列紊亂,呈波浪形改變,部分心肌纖維消失,炎性細胞浸潤。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,心肌細胞腫脹、心肌纖維結(jié)構(gòu)排列情況、炎性細胞浸潤等均呈現(xiàn)不能程度的改善,且改善程度逐漸增加。高劑量組大鼠心肌細胞形態(tài)、心肌纖維排列程度等均接近空白組,改善程度最佳。4.大鼠血清BNP的水平:ELISA試劑盒檢測顯示:與空白相比較,模型組的BNP水平顯著升高,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)。然而,與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量逐漸增加,BNP水平逐漸降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,高劑量組BNP水平明顯減低(p0.05)。5.大鼠心肌細胞的凋亡情況:TUNEL檢測顯示,與空白相比較,模型組心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素劑量的增加,心肌細胞的凋亡指數(shù)均有不同程度的降低,中劑量組、高劑量組凋亡指數(shù)均明顯減低(p0.05,p0.01),低劑量組凋亡指數(shù)減低無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。雷帕霉素高劑量組心肌細胞凋亡指數(shù)明顯低于低劑量組(p0.05)。6.大鼠心肌細胞AKT蛋白磷酸化情況:Western Blot檢測顯示,與空白組比較,模型組p-AKT蛋白表達明顯增加,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素劑量增加,p-AKT蛋白表達逐漸降低。雷帕霉素低、中、高劑量組p-AKT蛋白表達均明顯低于模型組(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,中、高劑量組p-AKT蛋白表達明顯降低(p0.05)。研究結(jié)論1.雷帕霉素可以呈劑量依賴性改善心力衰竭大鼠的一般狀態(tài),提高心力衰竭大鼠的生存質(zhì)量。2.雷帕霉素能夠呈劑量依賴性的改善心力衰竭大鼠超聲心動圖的各項指標(biāo),降低LVIDd、LVIDs,升高LVEF、LVFS,逆轉(zhuǎn)心腔擴大,增強大鼠的心臟射血功能,對心力衰竭大鼠的心衰進展有明顯的預(yù)防作用,可以延緩心力衰竭的進展。3.雷帕霉素可以呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)心力衰竭大鼠心臟擴大等肉眼改變及心肌細胞水腫、心肌纖維排列紊亂及炎性細胞浸潤等病理改變,延緩心肌組織重塑,改善心力衰竭大鼠心臟功能。4.雷帕霉素呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠血清中心力衰竭標(biāo)志物BNP的水平,改善大鼠的心臟功能。5.壓力負荷增加誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌細胞發(fā)生了細胞凋亡,細胞凋亡在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。而雷帕霉素可以呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡指數(shù),減輕心肌細胞凋亡,從而改善心力衰竭大鼠心臟功能。6.雷帕霉素可以呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠心肌組織中PI3K-AKT-mTOR信號通路的關(guān)鍵蛋白AKT的過度磷酸化表達。7.綜合以上各方面的實驗結(jié)果,我們得出初步結(jié)論,雷帕霉素可能通過對于AKT蛋白過度磷酸化的抑制來影響PI3K-AKT-mTOR信號通路,減輕心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡水平,從而提高左室射血分數(shù),降低血清BNP水平、逆轉(zhuǎn)心臟擴大和心肌組織病理改變,延緩心力衰竭進展,達到改善心力衰竭大鼠心臟功能的效果,我們的結(jié)果為雷帕霉素在心力衰竭臨床應(yīng)用提供一定的動物實驗理論依據(jù)。
【圖文】：

組別邐例數(shù)（ｎ）邐ＬＶＩＤｄ（ｒａｍ）邐ＬＶＩＤｓ邋（ｍｍ）邐ＬＶＥＦ（％）邐ＬＶＦＳ（％）逡逑空白組邐１０邐５．４６±０．３４邐２．８９±０．２１邐８８．４６土３．邋１４邐５７．２１±１．２９逡逑模型組邐１０邐７．２４±０＿１６”邐４＿０９±０．１廣邐６２．邋１８±２．邋１９＊＊邐３０．４0±１．０廣逡逑低劑量組邐ｌ0邐６．邋９８±０．邋４３＂＊邐３．邋７９±０．邋２４＿邐６９．邋２２土２．邋２１＿邐３７．邋５２±邋１．邋５７＊＊＊逡逑中劑量組邐１０邋６．邋４２邋±０．１邋ｒ＊＊Ａ邋３．邋３３±０．５４＊＊邋７４．邋０４±邋１．邋６４＊＊＊Ａ邋４５．邋７５±０．邋８９＊＊＃ｓ逡逑高劑量組邐ｌ0邋５．邋９７±０．３２＿邋３．０４±０．邋１９＿邋８０．１８±２．邋８９＿Ａ邋４８．３２±１．邋１２＿逡逑注：＊Ｐ＜０．邋０５，邋＊＊Ｐ＜０．邋０１邋ｖｓ邋空白組；＃Ｐ＜０．邋０５，邋＊＊Ｐ＜０．邋０１邋ｖｓ邋模型組；ＡＰ＜０．邋０５，逡逑ＡＡＰ〈０．邋０１邋ｖｓ低劑量組。逡逑

３．２邋ＨＥ染色逡逑解剖各組大鼠后，將每組大鼠的左室心肌切片，，做ＨＥ染色，各種大鼠心肌逡逑組織ＨＥ染色在光鏡下的具體圖片見附圖２�？瞻捉M大鼠：心肌細胞排列整齊、逡逑心肌纖維呈平行排列且緊密，呈束狀，橫紋清晰可見，胞核清晰，心肌細胞形態(tài)逡逑大小正常，無心肌細胞水腫、變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變，無炎性細胞的浸潤；心逡逑力衰竭模型組大鼠：心肌細胞肥大、水腫、胞漿疏松，有大量空泡，其大小和形逡逑狀不同，心肌細胞形態(tài)各異。心肌纖維斷裂、腫脹，心肌纖維排列紊亂，呈波浪逡逑形改變，部分心肌纖維消失，炎性細胞浸潤明顯；與單純模型組相比，雷帕霉素逡逑＋各模型組，心肌細胞腫脹、排列結(jié)構(gòu)情況、炎性細胞浸潤等方面均有不同程度逡逑的改善，且隨著雷帕霉素劑量的增加，改善程度逐漸增加。其中高劑量組心肌細逡逑胞形態(tài)、心肌纖維排列程度等均接近空白組
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6

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本文編號：2659518