【摘要】：研究背景心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征,由于心臟結(jié)構(gòu)或功能的異常,損害了心臟的充盈或射血能力,導(dǎo)致心輸出量不能滿足機(jī)體組織代謝需要。常見的臨床癥狀包括呼吸困難、體力活動(dòng)受限、體液潴留等。心力衰竭的病理生理機(jī)制復(fù)雜,心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭的形成及進(jìn)展過程中起著重要的作用,抑制心肌細(xì)胞凋亡對于心力衰竭的防治具有積極的意義。磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)信號傳導(dǎo)通路參與哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控,其中AKT蛋白的活性在心力衰竭過程中變化復(fù)雜。有研究顯示,長期AKT蛋白活化可以引起心肌細(xì)胞的病理性肥大與心腔擴(kuò)大,導(dǎo)致心臟收縮功能障礙,加速心力衰竭惡化。晚期心力衰竭病人AKT蛋白磷酸化升高,經(jīng)過左室輔助裝置治療后,AKT蛋白磷酸化顯著下降,心功能明顯改善。但是也有報(bào)道顯示AKT的短期活化可以抑制細(xì)胞凋亡因子、促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝及抑制炎癥反應(yīng),逆向改善心功能,對心力衰竭的患者有益。雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,近年來的研究發(fā)現(xiàn)其具有心臟保護(hù)作用。雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)壓力負(fù)荷增加引起的心肌肥厚和心臟擴(kuò)大,改善心臟功能。也有研究表明,雷帕霉素作為mTOR抑制劑,不同劑量條件下對AKT蛋白活性影響不同。在低濃度條件下通過抑制mTORCl,可以增加AKT蛋白的活性,而在高濃度條件下,雷帕霉素則可以抑制AKT蛋白的活性,機(jī)制可能主要是通過mTORC2通路。然而,據(jù)我們調(diào)研,國內(nèi)外目前尚沒有大規(guī)模的研究關(guān)注雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響以及PI3K-AKT-mTOR通路的AKT蛋白在此進(jìn)展過程中的作用。研究目的本實(shí)驗(yàn)研究旨在評價(jià)不同劑量的雷帕霉素對心力衰竭大鼠心臟的干預(yù)效果,以超聲心動(dòng)圖、BNP、心肌組織病理改變、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及心肌組織AKT蛋白磷酸化等指標(biāo),探討雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞PI3K-AKT-mTOR信號通路中AKT蛋白活性變化及心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能的影響,期待能夠?yàn)槔着撩顾貙π募〖?xì)胞的保護(hù)作用和心力衰竭藥物治療的進(jìn)展提供一些新的理論依據(jù)。研究方法65只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組(n=10,空白組)。其余采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)的方法建立大鼠心力衰竭模型,8周后將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組(n=10)、低劑量雷帕霉素+模型組(n=10,1mg/kg/d;低劑量組)、中劑量雷帕霉素+模型組(n=10,2.5 mg/kg/d;中劑量組)、高劑量雷帕霉素+模型組(n=10,4.5 mg/kg/d;高劑量組)。雷帕霉素通過尾靜脈注射,連續(xù)給藥四周。治療結(jié)束后,觀察大鼠的一般情況,應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評價(jià)大鼠的心臟功能,用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中B型腦鈉肽水平,HE染色觀察大鼠心肌組織的病理變化,TUNEL法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況,Western Blot檢測大鼠心肌組織中PI3K-AKT-mTOR信號通路的關(guān)鍵蛋白AKT磷酸化的表達(dá)情況。明確不同劑量的雷帕霉素對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞中AKT蛋白磷酸化表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能的影響。研究結(jié)果1.大鼠一般狀態(tài):空白組大鼠生長良好,一般狀態(tài)與生存質(zhì)量可;模型組大鼠逐漸出現(xiàn)心功能不全的癥狀與體征,一般狀態(tài)與生存質(zhì)量差。與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的逐漸增加,一般狀態(tài)改善以及生存質(zhì)量提高的程度均逐漸增加,以高劑量組大鼠改善與提高的程度最明顯。2.超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果:與空白組比較,模型組室壁運(yùn)動(dòng)減弱,左室舒張末徑(LVIDd,mm)和左室收縮末徑(LVIDs,mm)明顯增加(p0.01),左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF,%)和左室短軸縮短率(LVFS,%)明顯減低(p0.01)。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,室壁運(yùn)動(dòng)逐漸增強(qiáng),LVIDd、LVIDs數(shù)值逐漸降低,LVEF、LVFS數(shù)值逐漸增加(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,中、大劑量雷帕霉素給藥組的LVIDd、LVIDs值均減低,LVEF、LVFS均增加(p0.05,p0.01)。3.大鼠組織形態(tài)學(xué)變化:肉眼觀察心臟大體形態(tài)發(fā)現(xiàn),空白組大鼠心臟幾何形態(tài)完整,心腔大小正常,呈鮮紅色,彈性及韌性良好。模型組大鼠心臟失去原有的幾何形態(tài),心腔明顯擴(kuò)大,呈暗紅色,彈性及韌性差。雷帕霉素+模型各組心腔均有不同程度擴(kuò)大,但與模型組相比,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,心腔擴(kuò)大程度逐漸減低,顏色呈暗紅色,彈性及韌性尚可。用HE染色觀察心肌組織病理改變,包括心肌細(xì)胞大小及水腫情況、心肌纖維結(jié)構(gòu)排列情況、細(xì)胞間質(zhì)改變等�？瞻捉M大鼠:心肌細(xì)胞排列整齊、心肌纖維呈平行排列且緊密,呈束狀,橫紋清晰可見,胞核清晰,心肌細(xì)胞形態(tài)大小正常。模型組大鼠:心肌細(xì)胞水腫、肥大,有大量空泡,其大小和形狀不同,心肌細(xì)胞形態(tài)各異。心肌纖維斷裂、排列紊亂,呈波浪形改變,部分心肌纖維消失,炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量的增加,心肌細(xì)胞腫脹、心肌纖維結(jié)構(gòu)排列情況、炎性細(xì)胞浸潤等均呈現(xiàn)不能程度的改善,且改善程度逐漸增加。高劑量組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、心肌纖維排列程度等均接近空白組,改善程度最佳。4.大鼠血清BNP的水平:ELISA試劑盒檢測顯示:與空白相比較,模型組的BNP水平顯著升高,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。然而,與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素給藥劑量逐漸增加,BNP水平逐漸降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,高劑量組BNP水平明顯減低(p0.05)。5.大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況:TUNEL檢測顯示,與空白相比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。與模型組相比,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素劑量的增加,心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)均有不同程度的降低,中劑量組、高劑量組凋亡指數(shù)均明顯減低(p0.05,p0.01),低劑量組凋亡指數(shù)減低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。雷帕霉素高劑量組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于低劑量組(p0.05)。6.大鼠心肌細(xì)胞AKT蛋白磷酸化情況:Western Blot檢測顯示,與空白組比較,模型組p-AKT蛋白表達(dá)明顯增加,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。與模型組比較,雷帕霉素+模型各組,隨著雷帕霉素劑量增加,p-AKT蛋白表達(dá)逐漸降低。雷帕霉素低、中、高劑量組p-AKT蛋白表達(dá)均明顯低于模型組(p0.05,p0.01)。與低劑量組相比,中、高劑量組p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低(p0.05)。研究結(jié)論1.雷帕霉素可以呈劑量依賴性改善心力衰竭大鼠的一般狀態(tài),提高心力衰竭大鼠的生存質(zhì)量。2.雷帕霉素能夠呈劑量依賴性的改善心力衰竭大鼠超聲心動(dòng)圖的各項(xiàng)指標(biāo),降低LVIDd、LVIDs,升高LVEF、LVFS,逆轉(zhuǎn)心腔擴(kuò)大,增強(qiáng)大鼠的心臟射血功能,對心力衰竭大鼠的心衰進(jìn)展有明顯的預(yù)防作用,可以延緩心力衰竭的進(jìn)展。3.雷帕霉素可以呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)心力衰竭大鼠心臟擴(kuò)大等肉眼改變及心肌細(xì)胞水腫、心肌纖維排列紊亂及炎性細(xì)胞浸潤等病理改變,延緩心肌組織重塑,改善心力衰竭大鼠心臟功能。4.雷帕霉素呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠血清中心力衰竭標(biāo)志物BNP的水平,改善大鼠的心臟功能。5.壓力負(fù)荷增加誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。而雷帕霉素可以呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),減輕心肌細(xì)胞凋亡,從而改善心力衰竭大鼠心臟功能。6.雷帕霉素可以呈劑量依賴性降低心力衰竭大鼠心肌組織中PI3K-AKT-mTOR信號通路的關(guān)鍵蛋白AKT的過度磷酸化表達(dá)。7.綜合以上各方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們得出初步結(jié)論,雷帕霉素可能通過對于AKT蛋白過度磷酸化的抑制來影響PI3K-AKT-mTOR信號通路,減輕心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平,從而提高左室射血分?jǐn)?shù),降低血清BNP水平、逆轉(zhuǎn)心臟擴(kuò)大和心肌組織病理改變,延緩心力衰竭進(jìn)展,達(dá)到改善心力衰竭大鼠心臟功能的效果,我們的結(jié)果為雷帕霉素在心力衰竭臨床應(yīng)用提供一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
【圖文】：

組別邐例數(shù)（ｎ）邐ＬＶＩＤｄ（ｒａｍ）邐ＬＶＩＤｓ邋（ｍｍ）邐ＬＶＥＦ（％）邐ＬＶＦＳ（％）逡逑空白組邐１０邐５．４６±０．３４邐２．８９±０．２１邐８８．４６土３．邋１４邐５７．２１±１．２９逡逑模型組邐１０邐７．２４±０＿１６”邐４＿０９±０．１廣邐６２．邋１８±２．邋１９＊＊邐３０．４0±１．０廣逡逑低劑量組邐ｌ0邐６．邋９８±０．邋４３＂＊邐３．邋７９±０．邋２４＿邐６９．邋２２土２．邋２１＿邐３７．邋５２±邋１．邋５７＊＊＊逡逑中劑量組邐１０邋６．邋４２邋±０．１邋ｒ＊＊Ａ邋３．邋３３±０．５４＊＊邋７４．邋０４±邋１．邋６４＊＊＊Ａ邋４５．邋７５±０．邋８９＊＊＃ｓ逡逑高劑量組邐ｌ0邋５．邋９７±０．３２＿邋３．０４±０．邋１９＿邋８０．１８±２．邋８９＿Ａ邋４８．３２±１．邋１２＿逡逑注：＊Ｐ＜０．邋０５，邋＊＊Ｐ＜０．邋０１邋ｖｓ邋空白組；＃Ｐ＜０．邋０５，邋＊＊Ｐ＜０．邋０１邋ｖｓ邋模型組；ＡＰ＜０．邋０５，逡逑ＡＡＰ〈０．邋０１邋ｖｓ低劑量組。逡逑

３．２邋ＨＥ染色逡逑解剖各組大鼠后，將每組大鼠的左室心肌切片，，做ＨＥ染色，各種大鼠心肌逡逑組織ＨＥ染色在光鏡下的具體圖片見附圖２�？瞻捉M大鼠：心肌細(xì)胞排列整齊、逡逑心肌纖維呈平行排列且緊密，呈束狀，橫紋清晰可見，胞核清晰，心肌細(xì)胞形態(tài)逡逑大小正常，無心肌細(xì)胞水腫、變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變，無炎性細(xì)胞的浸潤；心逡逑力衰竭模型組大鼠：心肌細(xì)胞肥大、水腫、胞漿疏松，有大量空泡，其大小和形逡逑狀不同，心肌細(xì)胞形態(tài)各異。心肌纖維斷裂、腫脹，心肌纖維排列紊亂，呈波浪逡逑形改變，部分心肌纖維消失，炎性細(xì)胞浸潤明顯；與單純模型組相比，雷帕霉素逡逑＋各模型組，心肌細(xì)胞腫脹、排列結(jié)構(gòu)情況、炎性細(xì)胞浸潤等方面均有不同程度逡逑的改善，且隨著雷帕霉素劑量的增加，改善程度逐漸增加。其中高劑量組心肌細(xì)逡逑胞形態(tài)、心肌纖維排列程度等均接近空白組
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6

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本文編號：2659518