【摘要】：心房顫動(Atrial fibrillation,AF)簡稱AF,是臨床上最常見的房性心律失常,AF的并發(fā)癥以及病死率近年來逐年增高,為臨床AF治療帶來一定的挑戰(zhàn)。AF的具體發(fā)生病理生理機制仍未明確。肺靜脈的局灶激動對于AF的發(fā)生至關(guān)重要,但是在AF維持階段,心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及電生理重構(gòu)也起到至關(guān)重要的作用,在持續(xù)性AF的研究中發(fā)現(xiàn),心肌細胞中Ca~(2+)的釋放異常被認為是最核心的一環(huán)。而大量研究證實,細胞自噬(Autophagy)在心肌損傷中扮演著重要的角色,它是一種由氧化應(yīng)激、損傷、缺血等誘發(fā)的非凋亡性、程序性細胞死亡方式。目前研究認為,自噬是細胞纖維化的初始狀態(tài),而且大量動物研究亦證實AF細胞中存在著自噬性細胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的自噬已在多種疾病和病理過程中被觀察到。ERS反應(yīng)主要通過IRE1/JNK通路可以促進細胞自噬的發(fā)生,已被證實可以直接影響自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1以及Bcl-2的磷酸化,促進細胞自噬的發(fā)生,而ERS亦可以通過MAPKs(mitogen-activated protein kinases)通路促發(fā)心肌細胞自噬,進一步引起心房肌纖維化,在AF發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用。鈣蛋白酶-1(Calpain-1)Calpain-1可通過調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)而在AF發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。ERS與AF密切相關(guān),ERS-自噬反應(yīng)可促進心房肌細胞纖維化的發(fā)生,而心房肌纖維化是AF發(fā)生的重要病理性結(jié)構(gòu)重構(gòu),進而在AF發(fā)生機制中起到重要作用。Calpain-1在ERS的發(fā)生機制中起到重要的調(diào)節(jié)作用,因此,Calpain-1與ERS的相互作用是否是引起AF發(fā)生的重要機制之一呢?這是一個值得深入研究的問題。本課題將在業(yè)已建立的快速起搏心房兔AF模型上,從整體、細胞及超微結(jié)構(gòu)水平,深入探討Calpain-1對ERS-自噬表達水平變化的影響,并重點研究其對肌漿網(wǎng)鈣離子熒光強度事件以及延遲后除極(delayed after depolarization,DAD)等異常電觸發(fā)活動的調(diào)控機制,明確Calpain-1與ERS-自噬的相互作用在AF發(fā)生機制中的作用及意義,有助于揭示AF發(fā)生及發(fā)展的可能電重構(gòu)以及結(jié)構(gòu)重構(gòu)機制,為AF治療靶向藥物的研發(fā),提供新的思路和理論依據(jù)。第一部分AF患者心房肌Calpain-1及ERS-自噬相關(guān)基因表達的研究一、研究目的通過臨床AF患者以及竇律患者心房肌組織標本的研究明確Calpain-1、ERS-自噬相關(guān)基因在AF發(fā)生中作用以及與AF發(fā)生的相關(guān)關(guān)系。二、研究方法選取2015年1月至2016年12月在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院心臟外科住院的合并AF并因二尖瓣病變擬行二尖瓣置換或成形手術(shù)的手術(shù)患者,獲得心房肌組織標本,采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印跡以及QT-PCR等方法,檢測Calpain-1蛋白與mRNA表達以及酶活性的變化,并對ERS以及自噬相關(guān)蛋白與mRNA進行檢測,明確在AF發(fā)生中作用與關(guān)系。三、結(jié)果1、兩組患者在性別、年齡以及其他實驗室方面無明顯差異,在主動脈阻斷時間、體外循環(huán)時間等手術(shù)相關(guān)資料方面亦無明顯差異;2、AF患者心房肌組織中細胞數(shù)目較SR組明顯減少,排列稍紊亂,結(jié)締組織增生明顯,偶可見肌細胞溶解;3、相比于SR組心房肌細胞,AF組心房肌細胞Calpain-1的蛋白以及酶活性表達相對值明顯升高;4、AF組心房肌細胞ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表達量與mRNA相比于SR組顯著升高;5、AF組患者心房肌細胞自噬相關(guān)特異性蛋白LC3B-II與Beclin-1含量均較SR組心房肌細胞明顯增高。四、結(jié)論1、AF患者心房肌細胞中Calpain-1的蛋白表達明顯增高,且Calpain-1酶活性亦顯著高于SR患者;2、AF的患者心房肌細胞中ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表達以及mRNA含量明顯高于SR患者心房肌細胞;3、AF的患者心房肌細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B-II以及Beclin-I的表達以及mRNA含量明顯高于SR患者心房肌細胞。第二部分Calpain-1對ERS-自噬相關(guān)基因表達影響的實驗研究一、研究目的明確Calpain-1在AF動物模型心房組織中mRNA及蛋白表達變化的規(guī)律以及Calpain-1在AF動物模型中對ERS-自噬反應(yīng)關(guān)鍵蛋白的影響變化。二、研究方法采用遙測心電快速起搏方法建立的新西蘭大白兔AF模型,并通過Calpain-1特異性抑制劑進行干預(yù)實驗,將實驗動物分成Sham組,AF組以及AF+MD28170三組。在實驗處理后去兔心房肌細胞進行實驗室檢測。采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印跡、QT-PCR、電子透射電鏡以及免疫熒光共聚焦等方法,對各組實驗動物心房肌細胞檢測Calpain-1蛋白與mRNA表達以及酶活性的變化、ERS以及自噬相關(guān)蛋白與mRNA表達情況、心房肌細胞自噬形態(tài)學(xué)變化以及鈣離子熒光強度事件進行檢測,明確Calpain-1在AF中對ERS-自噬反應(yīng)關(guān)鍵蛋白的影響變化。三、結(jié)果1、各組AF自發(fā)持續(xù)率有顯著差異,但AF與AF+MDL28170組AF兩組比較無顯著差異,各組AF持續(xù)時間無顯著差異;2、AF組心肌細胞間質(zhì)可見藍染的膠原纖維明顯增多,膠原纖維增生加重,膠原纖維相互交織,AF+MDL28170組心肌細胞較AF組細胞間質(zhì)膠原纖維含量較AF組明顯減少,心肌排列稍有序;3、AF組Calpain-Ⅰ蛋白以及酶活性表達明顯上調(diào),但相比于AF組與Sham組,AF+MDL28170組Calpain-Ⅰ蛋白以及酶活性表達顯著降低;4、AF組較AF+MDL28170組GRP78以及CHOP蛋白以及mRNA表達顯著升高,但p-PERK以及ATF6表達差異不顯著;5、AF組以及AF+MDL28170組自噬相關(guān)特異性蛋白LC3B-II與Beclin-1表達均較Sham組心房肌細胞明顯增高;6、AF組心房肌細胞的自噬小體以及LC3B-II熒光點顯著增多,AF+MDL28170組自噬小體與LC3B-II熒光點相比AF組顯著減少,但仍較Sham組增多;7、與AF組相比,AF+MDL28170組胞質(zhì)中鈣離子熒光強度較稍有減弱,但仍較Sham組明顯增強。四、結(jié)論1、在快速起搏兔AF模型中,AF組以及Calpain-1抑制劑組中ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表達以及mRNA含量表達較正常組顯著增加;2、AF組動物模型心肌細胞中CHOP的表達以及mRNA含量明顯高于Calpain-1抑制劑組;3、AF的心房肌細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B-II以及自噬流表達顯著增高。第三部分Calpain-1通過ERS-自噬反應(yīng)在AF發(fā)生機制中作用的研究一、研究目的明確Calpain-1通過ERS-自噬通路表達變化在AF動物模型中的表達變化以及對AF發(fā)生可能的機制作用。二、研究方法在第二部分基礎(chǔ)上,仍采用遙測心電快速起搏方法建立的新西蘭大白兔AF模型,并通過ERS激活劑、抑制劑以及Calpai-I特異性抑制劑進行干預(yù)實驗將實驗動物分成6組。同樣采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印跡、QT-PCR、電子透射電鏡以及免疫熒光共聚焦等方法,對各組實驗動物心房肌細胞Calpain-1酶活性的變化、ERS以及自噬相關(guān)蛋白與mRNA表達情況、心房肌細胞自噬形態(tài)學(xué)變化以及鈣離子熒光強度事件進行檢測,明確Calpain-1在AF中通過ERS對心房肌細胞自噬以及鈣離子熒光強度的影響。三、結(jié)果1、AF,AF+MT心肌細胞間質(zhì)可見藍染的膠原纖維明顯增多,膠原纖維增生加重,心肌排列紊亂,可見稍許細胞核裂解;2、AF、AF+4PBA以及AF+MT組Calpain-Ⅰ蛋白及酶活性明顯增加,此外,Sham組Calpain-Ⅰ蛋白但相比于AF+MDL28170+4PBA以及AF+MDL28170+MT組表達增高;3、AF+MT組ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP含量表達最顯著,AF與AF+MDL28170+MT組ERS相關(guān)蛋白表達低于AF+MT組,但高于Sham、AF+4-PBA以及AF+MDL28170+4-PBA組;4、AF組以及AF+MDL28170組自噬相關(guān)特異性蛋白LC3B-II與Beclin-1表達均較Sham組心房肌細胞明顯增高,與AF組相比,AF+MT組自噬相關(guān)蛋白顯著增高,但與AF+MDL28170+MT組無顯著差異;5、AF組以及AF+MT組相比于Sham組自噬小體以及LC3B-II熒光點相比其他組顯著增多,而以AF+MT組更明顯;AF+MDL28170+MT組心房肌細胞中自噬小體以及LC3B-II熒光點與AF組無顯著差異;6、AF+MT組胞質(zhì)中鈣離子熒光強度顯著增高,AF與AF+MDL28170+MT組鈣離子熒光強度明顯低于AF+MT組,但高于Sham、AF+4-PBA以及AF+MDL28170+4-PBA組。四、結(jié)論1、在快速起搏兔AF模型中,ERS激活劑可顯著增加心房肌細胞自噬相關(guān)蛋白Benlin-1以及LC3II-B的表達以及mRNA含量表達;2、Calpain-1在AF動物模型心房肌細胞中激活心房肌細胞自噬增加的程度可被ERS抑制劑降低;3、Calpain-1抑制劑聯(lián)合ERS抑制劑可顯著降低AF心房肌細胞自噬的程度和發(fā)生。綜上所述,Calpain-1可能通過ERS中CHOP信號通路進一步激活心房肌細胞的自噬水平,從而在AF發(fā)生機制中扮演重要角色。
【圖文】：

圖 1-1 患者篩選流程圖斷標準及心電圖（ECG）為主要檢查標準，ECG 標準不等或者間隔心房電活動間期時限＜200ms。定義按照 2017 年 AHA/ACC/HRS 房顫管理指南及方法儀器及設(shè)備機 丹麥Labogene公司機 丹麥Labogene公司鹽城航星公司CANNON公司（日本

圖 1-2 AF 及竇律患者心房肌組織 HE 與 MASSON 染色（×200 倍）圖 A：SR 組心房組織 心房肌細胞總體排列整齊，緊密有致，肌纖維連續(xù)性好，心肌細胞核大小有致。圖 B：AF 組心房組織 心肌細胞排列亦紊亂，細胞數(shù)目較 SR 組減少，部分區(qū)域可見肌細胞溶解，且心肌間質(zhì)可見部分不規(guī)則結(jié)締組織增生。圖 C：SR 組心房組織心肌細胞排列有序，心肌間纖維分布稀疏，粗細交織呈條狀排列，膠原纖維含量較少。圖 D：AF 組心房組織 心肌組織排列雜亂，藍染的纖維束分布于心肌組織之間，部分缺乏正常的結(jié)構(gòu)，細胞間隙可見大量藍染的膠原纖維，相互交織，粗細不等。（二）心肌組織 Calpain-1 蛋白表達以及酶活性檢測結(jié)果我們通過 WB 方法檢測了 SR 以及 AF 患者心房肌細胞中 Calpain-1 的蛋白表達含量 1-3），通過計算各條帶灰度值并進行統(tǒng)計分析（圖 1-4）。AF 組 Calpain-Ⅰ蛋白表顯上調(diào)，相比于 SR 組顯著升高，，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（1.454±0.124 vs 0.965±0.2130.001）。此外，通過 Calpain-1 酶活性試劑盒檢測，AF 組患者心房肌細胞 Calpain-性顯著高于 SR 組（圖 1-5）（2.236±0.064 vs 0.985±0.011，P＜0.001）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.75

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本文編號：2652855