【摘要】：研究背景及目標(biāo):心肌肥厚是由于多種因素導(dǎo)致心臟的肥厚性病理改變,可逐漸導(dǎo)致心臟功能下降,心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)增生是其最基本的特征。心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明。最近研究發(fā)現(xiàn)microRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用,與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究的目的是觀察miR-214在心肌肥厚發(fā)病中的作用并探討詳細(xì)的作用機(jī)制。研究方法:1C57BL/6野生型小鼠(WT)150只分成3個(gè)體重組(n=50)后再分成5個(gè)小組(n=10)分別用作4個(gè)腹主動(dòng)脈縮窄組(AAC組)及假手術(shù)組(sham組),AAC組觀察存活率,統(tǒng)計(jì)心臟肥厚相關(guān)指數(shù),以尋找最適合的建模方式。2取新生大鼠原代心肌細(xì)胞通過(guò)苯腎上腺素刺激構(gòu)建心肌肥厚細(xì)胞模型,生物信息學(xué)篩查miR-214功能性靶基因,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、miR-214敲低和過(guò)表達(dá)后檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)變化等方法驗(yàn)證miR-214與預(yù)測(cè)靶基因的調(diào)控關(guān)系。并在蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證miR-214與其靶基因?qū)τ谛募》屎裣嚓P(guān)蛋白及下游信號(hào)通路的調(diào)控作用,探索詳細(xì)的作用機(jī)制。3獲得心肌miR-214條件性敲除(KO)小鼠并進(jìn)行鑒定,研究WT小鼠和KO小鼠AAC術(shù)后心肌肥厚的差異,以及miR-214靶基因相關(guān)蛋白的表達(dá)差異,進(jìn)一步在活體水平驗(yàn)證miR-214對(duì)于心肌肥厚的調(diào)控作用及相關(guān)的作用機(jī)制。結(jié)果:1AAC縮窄過(guò)重會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡,相同束縛強(qiáng)度下小鼠的死亡率和體重正相關(guān),使用0.45mm和0.50mm針頭都可以建立心肌肥厚模型,致使小鼠心肌細(xì)胞增大和間質(zhì)增生,心功能降低以及身體發(fā)育受限。2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)pim-1可能是miR-214的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-214可以結(jié)合在pim-1的3'UTR區(qū)域并降低pim-1的轉(zhuǎn)錄活性;通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲低miR-214的表達(dá)發(fā)現(xiàn),拮抗miR-214可以使pim-1的表達(dá)增加,反之,過(guò)表達(dá)miR-214可以抑制pim-1的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了 miR-214與pim-1之間存在直接的調(diào)控關(guān)系。3在心肌肥厚細(xì)胞模型中,過(guò)表達(dá)miR-214時(shí),心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物(ANP、BNP和Myh7)表達(dá)明顯降低,而在抑制miR-214的表達(dá)后,心肌肥厚相關(guān)蛋白明顯升高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),miR-214可以通過(guò)抑制pim-1的表達(dá),抑制JAK/STAT信號(hào)通路激活進(jìn)而影響心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的表達(dá)。4、WT小鼠心肌肥厚模型中,心肌miR-214表達(dá)下降,pim-1和ANP、BNP、Myh7蛋白表達(dá)增加;與此同時(shí),miR-214KO小鼠建模后心肌肥厚更為明顯,pim-1和ANP、BNP、Myh7的表達(dá)也更高。結(jié)論:本研究組成功建立了心肌肥厚模型,發(fā)現(xiàn)miR-214在心肌肥厚的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。miR-214可以通過(guò)降低pim-1的表達(dá),抑制JAK/STAT信號(hào)通路的激活,進(jìn)而降低了心肌肥厚程度。心肌miR-214缺失時(shí),心肌肥厚明顯加重。因此,miR-214可能是防治心肌肥厚的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

２原代心肌細(xì)胞經(jīng)ＰＥ處理后外徑和蛋白表達(dá)的變化。Ａ：邋４００ｘ顯微鏡下原代細(xì)胞的影像，與Ｃｔｒｌ組相比可見(jiàn)，ＰＥ組的原代心肌細(xì)胞更為飽滿，面積更大。逡逑：細(xì)胞外徑的統(tǒng)計(jì)，可見(jiàn)ＰＥ組有著顯著的提高。Ｃ：邋ＡＮＰ、ＢＮＰ和Ｍｙｈ７的ＷＢ影，可見(jiàn)經(jīng)ＰＥ處理后，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的表達(dá)都有不同程度的升高。逡逑．２邋ｍｉＲ－２１４在ｍＲＮＡ和蛋白水平調(diào)控ｐｉｍ－１表達(dá)逡逑（１）ｐｉｍ－ｌ的３’ＵＴＲ中可見(jiàn)兩個(gè)高度保守的ｍｉＲ－２１４的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于（ｔａｒｇｅｔ邋ｓｉｔｅｓ）邋６０８邋和邋１３４３。（圖邋３邋Ａ）逡逑（２）邐Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ邋ｍｅｌｔｉｎｇ繪制了核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)ｐｉｍ－１的３＇ＵＴＲ中的兩合位點(diǎn)均可以與ｍｉＲ－２１４的一部分序列結(jié)合，，并形成穩(wěn)定的核酸二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)逡逑（圖邋３邋Ｂ）。逡逑（３）邐ｍｉＲ－２１４已有被報(bào)道和心肌肥厚有關(guān)，ｐｉｍ－１也曾被報(bào)道對(duì)細(xì)胞增殖有關(guān)逡逑５］。逡逑

－２１４與ｐｉｍ－１的ｍＲＮＡ中互補(bǔ)基因序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖�？蓚�(gè)與ｍｉＲ－２１４的結(jié)合成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)，更進(jìn)一步依據(jù)。逡逑１４通過(guò)直接結(jié)合ｐｈｎ－１邋３＊１７０１下調(diào)ｐｉｍ－１的表達(dá)逡逑ｍｉＲ－２１４是否能夠直接結(jié)合ｐｉｍ－ｌ邋３＇ＵＴＲ，并且進(jìn)一步抑制ｐ對(duì)ｐｉｍ－１邋３’ＵＴＲ基因片段克隆了兩個(gè)具有高度保守的ｍｉＲ－過(guò)在其插入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行了檢測(cè)（ＷＴ－ｌｕｃ）。結(jié)行過(guò)表達(dá)后，受到ｐｉｍ－１邋３＇ＵＴＲ調(diào)控的熒光素酶的活性有著繼而我們對(duì)ｐｉｍ－１邋３＇ＵＴＲ上的ｍｉＲ－２１４的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)ａｎｔｌ－ｌｕｃ和Ｍｕｔａｎｔ２－丨ｕｃ具有單個(gè)位點(diǎn)突變的兩個(gè)報(bào)告質(zhì)粒，變的Ｍｕｔａｎｔｌ／２－ｌｕｃ報(bào)告質(zhì)粒（圖４Ｂ），并使用突變質(zhì)粒進(jìn)。，論Ｍｕｔａｎｔｌ－ｌｕｃ和Ｍｕｔａｎｔ２－ｌｕｃ，還是Ｍｕｔ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王永煜;余薇;周斌;;Hippo信號(hào)通路與心血管發(fā)育及疾病調(diào)控[J];遺傳;2017年07期

本文編號(hào)：2652338