【摘要】：背景伴隨著科技的進步、人們的生活節(jié)奏加快和飲食結構的變化,心血管疾病發(fā)病率逐年增加,并且趨于年輕化~([1])。心肌肥厚作為常見的心血管疾病,是一種可遺傳疾病,可由多種因素引起,特別是可由長期動脈血壓升高引發(fā),即壓力負荷型心肌肥厚,其與心力衰竭相關,繼而可能引發(fā)猝死。心肌肥厚是多種疾病的臨床征兆。近年來,表觀遺傳學機制異常在各種疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用受到普遍重視。甲基化是組蛋白非常重要的表觀遺傳修飾形式之一,同時也是調節(jié)基因組功能的重要手段。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(Lysine specific demethylase 1,LSD1)是第一個被發(fā)現的組蛋白特異性去甲基化酶。LSD1可以特異性催化組蛋白H3第4位賴氨酸H3K4和第9位賴氨酸H3K9一甲基化和二甲基化的去甲基修飾。多種腫瘤的發(fā)生與LSD1有關,也就是說LSD1的表觀遺傳學改變在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。然而對于LSD1在心肌肥厚中涉及的機制尚未闡明。本研究采用升主動脈縮窄手術制作壓力負荷型心肌肥厚大鼠模型,探討組蛋白去甲基化酶LSD1與壓力負荷型心肌肥厚的關系,為發(fā)現心肌肥厚機制及進一步治療奠定了基礎。目的1.探討壓力負荷型心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中LSD1的作用,了解組蛋白甲基化的狀態(tài)對壓力負荷型心肌肥厚的影響,從而為LSD1作為心肌肥厚臨床治療的新靶點提供理論依據。2.構建大鼠LSD1過表達質粒以及LSD1去甲基化活性中心缺失質粒,并在HEK293T細胞中實現LSD1基因的過表達,為進一步研究LSD1與相關疾病的關系以及LSD1去甲基化作用奠定了基礎。方法一、選取健康雄性SD大鼠,稱量體重為120~130 g,SPF級飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)大鼠,將實驗大鼠隨機分成3組:正常對照組(Control),假手術組(Sham)和升主動脈縮窄手術組(Transverse Aortic Constriction),每組6只。通過心重比、超聲心動、Western Blot、RT-qPCR、組織學HE染色、免疫組化檢測等多種實驗方法,檢測各組大鼠心臟功能、心肌肥厚表型、肥厚因子、LSD1及其下游組蛋白的表達。二、通過PCR擴增特異性LSD1片段,重疊PCR擴增LSD1特異性的去甲基化作用缺失片段,并構建大鼠特異性LSD1過表達質粒和LSD1去甲基化活性中心缺失質粒,并經瓊脂糖凝膠電泳和核酸測序進行驗證。將驗證后兩種質粒與空白載體分別進行包病毒,感染HEK293T后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞,再用Western blot和RT-qPCR等方法檢測HEK293T細胞內LSD1的表達情況。結果一、壓力負荷型心肌肥厚模型大鼠心肌LSD1表達變化心率和血壓結果顯示,與Control組和Sham組相比,TAC組動物心率、血壓均明顯升高,而Control組的心率血壓高于Sham組(n=6,*p0.05、***p0.0001)。超聲心動結果顯示,與Control組和Sham組相比,TAC組心肌出現明顯肥厚,室壁厚度明顯增加(LVPW及LVM顯著增加),心室腔縮小(LVID縮小),EF升高、FS升高(n=6,***P0.001、**P0.01)。心臟表型和心重比結果顯示,與Control組和Sham組相比,TAC組大鼠心臟明顯增大,心重比顯著升高,具有統(tǒng)計學意義(n=6,***p0.0001)。HE染色發(fā)現,與Control組和Sham組相比,TAC組心肌出現明顯肥厚,心肌細胞截面積明顯增大。心肌組織三種肥厚因子表達:qPCR結果顯示,與Control組和Sham組相比,TAC組大鼠心肌組織肌球蛋白輕鏈-2v(Myosin Light Chain 2v,MLC-2V)、α-型肌紅素重鏈(Alpha myosin Heavy chain,α-MHC)、心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide,ANP)mRNA表達均明顯上調(n=6,**p0.01、***p0.001)。心肌組織LSD1及下游組蛋白表達:qPCR、Western Blot、免疫組化研究表明,與Control組和Sham組相比,TAC組大鼠心肌組織mRNA、蛋白表達水平均顯著下降(n=6,p0.01),而進一步檢測發(fā)現TAC組大鼠心肌組蛋白H3第4位賴氨酸一甲基化修飾(H3K4me1),H3K4me2,H3K9me1,H3K9me2的水平明顯上調(n=6,**p0.01、***p0.001p0.01).二、構建LSD1過表達及去甲基化作用缺失質粒結果Western Blot與實時定量PCR檢測結果顯示,與空白對照組相比,LSD1過表達組和LSD1去甲基化活性中心缺失組HEK293T細胞中LSD1蛋白及mRNA的相對表達量均顯著上調(p0.01)。結論1.LSD1與壓力負荷型心肌肥厚的發(fā)生有關,持久的壓力負荷可能通過抑制LSD1表達、增加組蛋白甲基化的狀態(tài)而導致心肌肥厚。2.成功構建了大鼠LSD1過表達質粒以及LSD1去甲基化活性中心缺失質粒,并在HEK293T細胞中實現過表達,為進一步研究LSD1去甲基化作用與相關疾病的關系奠定了基礎。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 結結果2.1 結果2.1.1 心率和血壓圖 1 顯示：與 Control 組和 Sham 組相比，TAC 組大鼠心率（圖 1A）、血（圖 1 B）均明顯升高，而 Control 組的心率血壓高于 Sham 組（n=6，，*p<0**P<0.01、***p<0.0001）。TAC 手術 3 周可以使大鼠心率、動脈血壓明顯升持續(xù)的高后負荷是導致心肌肥厚的主要因素。

25圖 2. 超聲心動檢測結果圖（A）及心功能指標（B）結果顯示，與 Control 組和 Sham 組相比，TAC 組室壁厚度增加（A），LVPW 及 LVM 顯著增加、LVID 縮小， EF 升高、FS 升高（B）（n=6，*P<0.05，vs Control 及 Sham 組）。Figure 2. Echocardiography found an obvious cardiac hypertrophy in rats ofTAC group(A). The leftventricular posterior wall and left ventricular mass of ratsfrom TAC group were significantly thick compared with those of the rats from
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.2

【二級參考文獻】

相關碩士學位論文 前4條

1 周劍利;高中文科生數形結合思想方法的教學研究[D];湖南師范大學;2011年

2 劉興楠;數形結合思想在中學數學教學中的應用[D];遼寧師范大學;2011年

3 宋玉軍;高中數學有效運用數形結合思想的教學研究[D];東北師范大學;2010年

4 顧亞萍;數形結合思想方法之教學研究[D];南京師范大學;2004年

本文編號：2650159