【摘要】：動脈粥樣硬化是一種極具社會危害性的慢性疾病,主要表現(xiàn)為脂質(zhì)在內(nèi)皮下的沉積,炎性細胞浸潤及新內(nèi)膜形成。動脈粥樣硬化的發(fā)病率和致死率都非常高,已成為全球第一致死病因。目前,關(guān)于動脈粥樣硬化的發(fā)病機制眾說紛紜,其中最公認的是“血管內(nèi)皮細胞損傷反應(yīng)學(xué)說”及由其發(fā)展而來的“炎性理論”。內(nèi)皮功能損傷導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加,循環(huán)中的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)進入內(nèi)皮活化血管內(nèi)皮細胞�；罨膬�(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種粘附分子,誘導(dǎo)單核細胞的粘附和浸潤。單核細胞在巨噬細胞集落刺激因子的誘導(dǎo)下分化成巨噬細胞。巨噬細胞分泌的各種促炎性因子和生長因子刺激中膜內(nèi)血管平滑肌細胞的增殖和爬行,形成新內(nèi)膜。巨噬細胞連同新內(nèi)膜中的血管平滑肌細胞進一步大量攝入脂質(zhì)變成泡沫細胞,形成粥樣斑塊。肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)是細胞內(nèi)調(diào)控鈣的關(guān)鍵酶,主要作用是將細胞漿內(nèi)的鈣離子(Ca~(2+))攝入到肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER),對維持細胞內(nèi)Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)和ER穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。左心室肥大、心衰和動脈粥樣硬化等心血管疾病中,SERCA的活性或表達明顯下調(diào)。SERCA2是SERCA在血管系統(tǒng)的主要亞型,其674位的半胱氨酸(C674)是主要的氧化還原位點,調(diào)控SERCA2的功能。C674是受血管舒張因子一氧化氮調(diào)控的關(guān)鍵谷胱甘肽化位點,增加SERCA2的活性進而舒張血管;引起活性氧/氮自由基大量增加的病理情況都可以造成C674的不可逆性氧化,導(dǎo)致SERCA2失活及ER Ca~(2+)重吸收障礙,參與了心血管疾病的進程。在人的動脈粥樣硬化樣本中,C674的不可逆氧化明顯增加。關(guān)于SERCA2及病理情況下C674的不可逆氧化與動脈粥樣硬化的關(guān)系尚不清楚。我們將C674突變成絲氨酸(C674→S674)來模擬C674位點的不可逆性氧化對這一位點谷胱甘肽化的抑制,在SERCA2啟動子的調(diào)控下構(gòu)建了C674S基因突變敲入鼠(SERCA2C674S knock-in mouse,SKI)。我們的前期研究表明,純合子SKI死于血管發(fā)育的關(guān)鍵時期。雜合子SKI(以下簡稱SKI)下肢缺血后血流恢復(fù)緩慢,表明C674失活與病理性血管生成障礙相關(guān),其中內(nèi)皮細胞的功能障礙部分參與了阻礙新血管的生成。因為內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素,推測病理情況下內(nèi)皮細胞的C674不可逆氧化直接參與了動脈粥樣硬化的進程。本研究擬從內(nèi)皮細胞角度探討SERCA2 C674的失活與動脈粥樣硬化的關(guān)系及其相關(guān)調(diào)控機制,為動脈粥樣硬化臨床防治提供新的理論依據(jù)和干預(yù)靶點,具有較好的理論價值和臨床意義。材料和方法:為了探討SERCA2 C674的失活與動脈粥樣硬化的關(guān)系及其相關(guān)調(diào)控機制,我們將SKI轉(zhuǎn)入到動脈粥樣硬化易感的低密度脂蛋白受體基因缺陷(low density lipoprotein receptor deficient,LDLR-/-)遺傳背景,并飼喂高脂飲食來加速動脈粥樣硬化的進程。在培養(yǎng)的小鼠冠狀動脈內(nèi)皮細胞,分析功能及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及炎性因子的表達水平。SERCA2b是血管中SERCA2的主要基因型。與缺陷性腺病毒空載體(Adv)對照相比,分析過表達缺陷性腺病毒SERCA2b C674S對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和炎性因子的影響。結(jié)果:(1)與對照LDLR-/-小鼠相比,SKI/LDLR-/-小鼠的體重及血清中膽固醇和甘油三酯的含量沒有明顯差別,但它們主動脈弓和主動脈根部的脂質(zhì)沉積明顯增加,表明SERCA2 C674的失活加速動脈粥樣硬化的進程。(2)在分離培養(yǎng)的小鼠冠狀動脈內(nèi)皮細胞,與來自對照野生型小鼠(wild type,WT)的內(nèi)皮細胞相比,在來自SKI的內(nèi)皮細胞:1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白p-eIF2α和CHOP的表達明顯增加,而ERO1α表達降低,表明內(nèi)皮細胞中C674的失活誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;2)炎性因子VCAM1及調(diào)控炎性因子表達的Cav-1表達均增加,并且巨噬細胞對內(nèi)皮細胞的粘附增加;3)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達明顯增加。(3)在分離培養(yǎng)的WT冠狀動脈內(nèi)皮細胞,與過表達Adv對照相比,過表達SERCA2b C674S:1)明顯增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BiP、ATF6、CHOP以及介導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的LOX-1的表達水平,降低ERO1α的表達水平;2)明顯增加VCAM1和ICAM1等炎性因子和粘附分子的表達水平,增加趨化因子MCP-1的表達水平,并上調(diào)炎性相關(guān)因子TNF-α、IL-6的表達水平;3)上調(diào)調(diào)控血管重構(gòu)建的OPN、MMP2的表達水平并減少MMP抑制酶TIMP-1的表達水平;4)上調(diào)Cav-1的表達水平,并下調(diào)抗炎因子PPARγ的表達水平,表明SERCA2b C674的失活促進了內(nèi)皮細胞的炎性反應(yīng);5)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達水平。結(jié)論:病理情況下SERCA2 C674的不可逆氧化加速動脈粥樣硬化的進程。在內(nèi)皮細胞中,SERCA2 C674的部分失活誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的活化,促進巨噬細胞對內(nèi)皮細胞的粘附和浸潤。在內(nèi)皮細胞中,過表達SERCA2b C674S誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,增加炎性因子及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。我們推測,病理情況下SERCA2 C674的不可逆氧化導(dǎo)致的ER Ca~(2+)庫減少引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)及凋亡,從而加速動脈粥樣硬化的進程。
【圖文】：

重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文釋放 ICAM1、VCAM1 等粘附分子和趨化因子 MCP胞遷入內(nèi)皮下，，MMP2、MMP9、TNF-α、白介素-6（ininterleukin 6, IL-8）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）細胞增殖的抑制作用減弱；表面抗凝分子血栓調(diào)節(jié)素粘附能力降低，易形成血栓；血管舒張因子一氧化氮到破壞等。

課題假說Figure1.2.Thehypothesis.
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2649585