本文關(guān)鍵詞：非經(jīng)典NF-kB信號(hào)通路與B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤耐藥相關(guān)性的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的 B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin's Lymphoma, B-NHL)是惡性B細(xì)胞單克隆擴(kuò)增的一組異源性惡性致死性疾病。近年來,隨著研究和治療水平的不斷提高,尤其是利妥昔單抗(Rituximab)在臨床的廣泛應(yīng)用,患者生存期逐漸延長,部分患者可治愈。然而腫瘤細(xì)胞耐藥常導(dǎo)致治療無效或病情復(fù)發(fā),使一部分患者預(yù)后較差。目前研究表明,核因子KB(Nuclear Factor kappa B, NF-κB)信號(hào)通路的活化可能是B-NHL耐藥的主要原因之一。B-NHL患者外周血中B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor blonging to TNF family, BAFF)明顯升高,且與疾病的進(jìn)展性、嚴(yán)重程度及治療敏感性有關(guān)。BAFF受體(B cell activating factor receptor, BAFF-R, BR3)是BAFF專用的調(diào)節(jié)B細(xì)胞存活的特異性受體,而非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路是受BAFF/BAFF-R介導(dǎo)活化的主要通路。 我們前期在酵母三雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)受體相互作用絲/蘇氨酸激酶2(Receptor-Interacting Serine/Threonine Kinase2, RIPK2)與BAFF-R、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TNF receptor-associated factor3, TRAF3)三者間存在相互作用,其中TRAF3是非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)分子,具有重要的樞紐作用,提示RIPK2作為細(xì)胞內(nèi)蛋白,可能與BAFF/BAFF-R介導(dǎo)的非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路活化引起的淋巴瘤細(xì)胞耐藥之間具有潛在的聯(lián)系。 本課題通過檢測(cè)B-NHL患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及淋巴結(jié)腫瘤組織中,非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路相關(guān)目的基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平,研究其與B-NHL耐藥及疾病進(jìn)展的相關(guān)性。通過MTT比色法研究BAFF對(duì)人伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL) Raji細(xì)胞的促增殖作用,并用不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞后,從基因與蛋白水平檢測(cè)非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況,為B-NHL耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究提供線索,同時(shí)初步探討RIPK2與BAFF/BAFF-R介導(dǎo)的信號(hào)通路的相關(guān)性。 材料與方法 本課題的外周血標(biāo)本來源于2010年11月至2011年11月于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院住院治療的36例B-NHL患者,以及同期7名健康獻(xiàn)血員。淋巴結(jié)腫瘤組織標(biāo)本來源于2009年1月至2011年11月于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院住院治療的20例B-NHL患者。提取外周血及組織標(biāo)本總RNA,紫外光分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性；用PrimerScript Reverse Transcriptase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存。半定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction, SqRT-PCR)擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)檢測(cè)外周血PBMC及腫瘤組織中非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路相關(guān)目的基因及RIPK2mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)各項(xiàng)臨床特征對(duì)患者分組,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并應(yīng)用Pearson直線相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)兩兩目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平間的相關(guān)性,應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平與疾病進(jìn)展程度的相關(guān)性。 用不同濃度(62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)的重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞24h、48h、72h后,應(yīng)用MTT比色法研究BAFF對(duì)Raji細(xì)胞的促增殖作用。用不同濃度(20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL)的重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞后,分別利用FQ-PCR和Westen Blot技術(shù),檢測(cè)非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子基因與蛋白的表達(dá)情況,并用Pearson直線相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2與BAFF mRNAs相對(duì)表達(dá)水平間的相關(guān)性,用Spearman秩相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)各目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平與重組人BAFF濃度的相關(guān)性。同時(shí)初步探討RIPK2與BAFF/BAFF-R介導(dǎo)的非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1目的基因mRNAs在B-NHLPBMC中的表達(dá)情況：按臨床特征對(duì)B-NHL患者進(jìn)行分組,各B-NHL患者組PBMC BAFF、BAFF、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著升高,P0.05；男性組、淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(Lymphoma International Prognostic Index, IPI)評(píng)分0～2分組、年齡≥60歲組分別與女性組、IPI評(píng)分3～4分組、年齡60歲組比較,PBMC目的基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平無顯著性差異,P0.05；Ⅲ/Ⅳ期及耐藥組PBMC目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平分別高于Ⅰ/Ⅱ期及非耐藥組,P0.05。Pearson直線相關(guān)分析結(jié)果顯示,各目的基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平均相互呈正相關(guān)性,P0.0001,表明目的基因的表達(dá)趨勢(shì)具有一致性。對(duì)不同臨床分期、非耐藥/耐藥組的數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析,結(jié)果顯示各目的基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平與疾病進(jìn)展程度正相關(guān),P0.0001,提示隨著疾病的進(jìn)展,目的基因的表達(dá)隨之升高。 2B-NHL組織目的基因mRNAs表達(dá)情況： 按性別及IPI評(píng)分分組時(shí),各組目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。耐藥組Bcl-xL mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于非耐藥組,P0.05；耐藥組BAFF、BAFF-R、NIK、p52及RIPK2的表達(dá)水平較非耐藥組有升高趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05。 3重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)：不同濃度的重組人BAFF刺激人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞24h、48h、72h后,與對(duì)照組相比,各處理組OD值均有不同程度升高,不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)以及交互作用均有顯著性差異(F(4.24)=425.88,P0.0001；F(2.24)=519.73,P0.0001；F(8.24)=5.50,P0.0001)。表明BAFF可以促進(jìn)Raji:細(xì)胞的增殖,且隨著重組人BAFF濃度的增加和作用時(shí)間的延長,Raji細(xì)胞增殖率逐漸上升,P0.05,表明BAFF促增殖作用有明顯的劑量—效應(yīng)和時(shí)間一效應(yīng)依賴性。 4Raji細(xì)胞目的基因的FQ-PCR實(shí)驗(yàn)：加入不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞后,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNA的表達(dá)較陰性對(duì)照組均升高,P0.05。20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL3組之間,各目的基因mRNAs相對(duì)表達(dá)水平差異顯著,P0.05,且隨重組人BAFF濃度的升高呈上升趨勢(shì)。 Pearson直線相關(guān)分析結(jié)果顯示,BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2均與BAFF mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平正相關(guān),P0.0001。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,各目的基因mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平與重組人BAFF濃度正相關(guān),P0.0001,表明隨著重組人BAFF濃度的升高,目的基因的表達(dá)升高。 5Westen Blot實(shí)驗(yàn)： 以不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2蛋白的表達(dá)均隨重組人BAFF濃度的升高而呈增強(qiáng)趨勢(shì)。 結(jié)論與分析 Ⅲ/Ⅳ期、耐藥B-NHL患者PBMC BAFF、BAFF-R、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平分別高于Ⅰ/Ⅱ期、非耐藥B-NHL患者以及正常對(duì)照組,提示上述目的基因的表達(dá)與B-NHL耐藥及疾病進(jìn)展性相關(guān)。耐藥B-NHL腫瘤組織中BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平均高于非耐藥組,表明BAFF/BAFF-R介導(dǎo)的非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路與B-NHL細(xì)胞耐藥存在相關(guān)性,而RIPK2可能與該信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BAFF能促進(jìn)Raji;細(xì)胞增殖,且BAFF的促增殖作用具有劑量和時(shí)間效應(yīng)依賴關(guān)系。重組人BAFF刺激Raji細(xì)胞后,能激活非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路,其活化程度與重組人BAFF的濃度相關(guān),可引起下游靶蛋白Bcl-xL等抗凋亡因子的過表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活與增殖,表明BAFF可以通過非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路調(diào)控Raji細(xì)胞的增殖。同時(shí)BAFF可以上調(diào)RIPK2的表達(dá),提示RIPK2與非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路之間可能存在功能聯(lián)系。本課題為進(jìn)一步探討B(tài)-NHL的發(fā)生、發(fā)展及耐藥的生物學(xué)機(jī)制,提供了新的線索。
【關(guān)鍵詞】：B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL) 非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路 耐藥 BAFF Raji細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R733.1
【目錄】：

• 英文縮略詞對(duì)照表5-7
• 中文摘要7-11
• English Abstract11-15
• 前言15-19
• 第一部分 B-NHL患者中BAFF/BAFF-R介導(dǎo)的非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)與耐藥的相關(guān)性研究19-49
• 一 實(shí)驗(yàn)材料19-22
• 二 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-46
• 四 討論46-49
• 第二部分 BAFF對(duì)Raji細(xì)胞的增殖作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究49-73
• 一 實(shí)驗(yàn)材料49-53
• 二 實(shí)驗(yàn)方法53-61
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-70
• 四 討論70-73
• 全文小結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 文獻(xiàn)綜述79-87
• 參考文獻(xiàn)83-87
• 發(fā)表論著87-94
• 致謝94

【參考文獻(xiàn)】

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1 季美華;張冬雷;張桂華;陸_逞

本文編號(hào)：264820