本文關鍵詞：非經(jīng)典NF-kB信號通路與B細胞非霍奇金淋巴瘤耐藥相關性的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的 B細胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin's Lymphoma, B-NHL)是惡性B細胞單克隆擴增的一組異源性惡性致死性疾病。近年來,隨著研究和治療水平的不斷提高,尤其是利妥昔單抗(Rituximab)在臨床的廣泛應用,患者生存期逐漸延長,部分患者可治愈。然而腫瘤細胞耐藥常導致治療無效或病情復發(fā),使一部分患者預后較差。目前研究表明,核因子KB(Nuclear Factor kappa B, NF-κB)信號通路的活化可能是B-NHL耐藥的主要原因之一。B-NHL患者外周血中B細胞活化因子(B cell activating factor blonging to TNF family, BAFF)明顯升高,且與疾病的進展性、嚴重程度及治療敏感性有關。BAFF受體(B cell activating factor receptor, BAFF-R, BR3)是BAFF專用的調節(jié)B細胞存活的特異性受體,而非經(jīng)典NF-κB信號通路是受BAFF/BAFF-R介導活化的主要通路。 我們前期在酵母三雜交實驗中發(fā)現(xiàn)受體相互作用絲/蘇氨酸激酶2(Receptor-Interacting Serine/Threonine Kinase2, RIPK2)與BAFF-R、腫瘤壞死因子受體相關因子3(TNF receptor-associated factor3, TRAF3)三者間存在相互作用,其中TRAF3是非經(jīng)典NF-κB信號通路中的負調分子,具有重要的樞紐作用,提示RIPK2作為細胞內蛋白,可能與BAFF/BAFF-R介導的非經(jīng)典NF-κB信號通路活化引起的淋巴瘤細胞耐藥之間具有潛在的聯(lián)系。 本課題通過檢測B-NHL患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及淋巴結腫瘤組織中,非經(jīng)典NF-κB信號通路相關目的基因mRNAs的相對表達水平,研究其與B-NHL耐藥及疾病進展的相關性。通過MTT比色法研究BAFF對人伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL) Raji細胞的促增殖作用,并用不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細胞后,從基因與蛋白水平檢測非經(jīng)典NF-κB信號通路相關信號分子的表達情況,為B-NHL耐藥機制的進一步研究提供線索,同時初步探討RIPK2與BAFF/BAFF-R介導的信號通路的相關性。 材料與方法 本課題的外周血標本來源于2010年11月至2011年11月于軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院住院治療的36例B-NHL患者,以及同期7名健康獻血員。淋巴結腫瘤組織標本來源于2009年1月至2011年11月于軍事醫(yī)學科學院住院治療的20例B-NHL患者。提取外周血及組織標本總RNA,紫外光分光光度計及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和完整性；用PrimerScript Reverse Transcriptase將RNA反轉錄成cDNA,-20℃保存。半定量反轉錄—聚合酶鏈反應(semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction, SqRT-PCR)擴增內參GAPDH,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)檢測外周血PBMC及腫瘤組織中非經(jīng)典NF-κB信號通路相關目的基因及RIPK2mRNAs的相對表達水平,結果運用2-ΔΔCt法進行計算,根據(jù)各項臨床特征對患者分組,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,并應用Pearson直線相關分析統(tǒng)計兩兩目的基因mRNAs相對表達水平間的相關性,應用Spearman秩相關分析統(tǒng)計目的基因mRNAs相對表達水平與疾病進展程度的相關性。 用不同濃度(62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)的重組人BAFF刺激Raji細胞24h、48h、72h后,應用MTT比色法研究BAFF對Raji細胞的促增殖作用。用不同濃度(20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL)的重組人BAFF刺激Raji細胞后,分別利用FQ-PCR和Westen Blot技術,檢測非經(jīng)典NF-κB信號通路相關信號分子基因與蛋白的表達情況,并用Pearson直線相關分析統(tǒng)計BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2與BAFF mRNAs相對表達水平間的相關性,用Spearman秩相關分析統(tǒng)計各目的基因mRNAs相對表達水平與重組人BAFF濃度的相關性。同時初步探討RIPK2與BAFF/BAFF-R介導的非經(jīng)典NF-κB信號通路的關聯(lián)。 實驗結果 1目的基因mRNAs在B-NHLPBMC中的表達情況：按臨床特征對B-NHL患者進行分組,各B-NHL患者組PBMC BAFF、BAFF、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對表達水平均較正常對照組顯著升高,P0.05；男性組、淋巴瘤國際預后指數(shù)(Lymphoma International Prognostic Index, IPI)評分0～2分組、年齡≥60歲組分別與女性組、IPI評分3～4分組、年齡60歲組比較,PBMC目的基因mRNAs的相對表達水平無顯著性差異,P0.05；Ⅲ/Ⅳ期及耐藥組PBMC目的基因mRNAs相對表達水平分別高于Ⅰ/Ⅱ期及非耐藥組,P0.05。Pearson直線相關分析結果顯示,各目的基因mRNAs的相對表達水平均相互呈正相關性,P0.0001,表明目的基因的表達趨勢具有一致性。對不同臨床分期、非耐藥/耐藥組的數(shù)據(jù)進行Spearman秩相關分析,結果顯示各目的基因mRNAs的相對表達水平與疾病進展程度正相關,P0.0001,提示隨著疾病的進展,目的基因的表達隨之升高。 2B-NHL組織目的基因mRNAs表達情況： 按性別及IPI評分分組時,各組目的基因mRNAs相對表達水平無統(tǒng)計學差異。耐藥組Bcl-xL mRNAs的相對表達水平顯著高于非耐藥組,P0.05；耐藥組BAFF、BAFF-R、NIK、p52及RIPK2的表達水平較非耐藥組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異,P0.05。 3重組人BAFF刺激Raji細胞的MTT實驗：不同濃度的重組人BAFF刺激人Burkitt淋巴瘤Raji細胞24h、48h、72h后,與對照組相比,各處理組OD值均有不同程度升高,不同濃度、不同時間點以及交互作用均有顯著性差異(F(4.24)=425.88,P0.0001；F(2.24)=519.73,P0.0001；F(8.24)=5.50,P0.0001)。表明BAFF可以促進Raji:細胞的增殖,且隨著重組人BAFF濃度的增加和作用時間的延長,Raji細胞增殖率逐漸上升,P0.05,表明BAFF促增殖作用有明顯的劑量—效應和時間一效應依賴性。 4Raji細胞目的基因的FQ-PCR實驗：加入不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細胞后,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNA的表達較陰性對照組均升高,P0.05。20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL3組之間,各目的基因mRNAs相對表達水平差異顯著,P0.05,且隨重組人BAFF濃度的升高呈上升趨勢。 Pearson直線相關分析結果顯示,BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2均與BAFF mRNAs的相對表達水平正相關,P0.0001。Spearman秩相關分析結果顯示,各目的基因mRNAs的相對表達水平與重組人BAFF濃度正相關,P0.0001,表明隨著重組人BAFF濃度的升高,目的基因的表達升高。 5Westen Blot實驗： 以不同濃度的重組人BAFF刺激Raji細胞,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2蛋白的表達均隨重組人BAFF濃度的升高而呈增強趨勢。 結論與分析 Ⅲ/Ⅳ期、耐藥B-NHL患者PBMC BAFF、BAFF-R、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對表達水平分別高于Ⅰ/Ⅱ期、非耐藥B-NHL患者以及正常對照組,提示上述目的基因的表達與B-NHL耐藥及疾病進展性相關。耐藥B-NHL腫瘤組織中BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相對表達水平均高于非耐藥組,表明BAFF/BAFF-R介導的非經(jīng)典NF-κB信號通路與B-NHL細胞耐藥存在相關性,而RIPK2可能與該信號通路存在關聯(lián)。 MTT實驗結果顯示BAFF能促進Raji;細胞增殖,且BAFF的促增殖作用具有劑量和時間效應依賴關系。重組人BAFF刺激Raji細胞后,能激活非經(jīng)典NF-κB信號通路,其活化程度與重組人BAFF的濃度相關,可引起下游靶蛋白Bcl-xL等抗凋亡因子的過表達,促進腫瘤細胞存活與增殖,表明BAFF可以通過非經(jīng)典NF-κB信號通路調控Raji細胞的增殖。同時BAFF可以上調RIPK2的表達,提示RIPK2與非經(jīng)典NF-κB信號通路之間可能存在功能聯(lián)系。本課題為進一步探討B(tài)-NHL的發(fā)生、發(fā)展及耐藥的生物學機制,提供了新的線索。
【關鍵詞】：B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL) 非經(jīng)典NF-κB信號通路 耐藥 BAFF Raji細胞
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R733.1
【目錄】：

• 英文縮略詞對照表5-7
• 中文摘要7-11
• English Abstract11-15
• 前言15-19
• 第一部分 B-NHL患者中BAFF/BAFF-R介導的非經(jīng)典NF-κB信號通路相關基因表達與耐藥的相關性研究19-49
• 一 實驗材料19-22
• 二 實驗方法22-29
• 三 實驗結果29-46
• 四 討論46-49
• 第二部分 BAFF對Raji細胞的增殖作用及其調節(jié)機制的初步研究49-73
• 一 實驗材料49-53
• 二 實驗方法53-61
• 三 實驗結果61-70
• 四 討論70-73
• 全文小結73-75
• 參考文獻75-79
• 文獻綜述79-87
• 參考文獻83-87
• 發(fā)表論著87-94
• 致謝94

【參考文獻】

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1 季美華;張冬雷;張桂華;陸_逞

本文編號：264820