【摘要】：世界衛(wèi)生組織報(bào)告,冠心病已成為全球首位的死亡原因。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血引起的心肌細(xì)胞死亡。心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR)是指心肌梗死后在血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)體液等因素綜合作用下,心臟從基因到結(jié)構(gòu)發(fā)生改建,代謝和功能發(fā)生改變的過(guò)程。VR是急性心肌梗死后最終發(fā)展為心力衰竭(heart failure,HF)的基本病理過(guò)程,是影響急性心肌梗死預(yù)后的主要原因。因此,如何減緩或者逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死后的VR,預(yù)防HF的發(fā)生,是心肌梗死二級(jí)預(yù)防面臨的重大難題。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNA,lncRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200nt的轉(zhuǎn)錄本,其本身不能編碼蛋白。起初它被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能,然而,研究表明lncRNAs具有廣泛的生物學(xué)功能,它們以RNA形式在多種層面上調(diào)控基因表達(dá)水平。為探討復(fù)雜疾病的病理機(jī)制提供一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)基因芯片實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異表達(dá)的lncRNAs,以此為基礎(chǔ)期望能夠發(fā)現(xiàn)心室重構(gòu)特異lncRNA的靶標(biāo)基因,為心室重構(gòu)提供新的診斷依據(jù)和防治手段。目的:篩選心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異性表達(dá)的lncRNAs和mRNAs,并通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行功能、途徑富集和lncRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,以期找到與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)的靶標(biāo)基因。方法:1.大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)模型制備60只健康SPF級(jí)雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,體質(zhì)量(200±20)g基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)選取45只大鼠在左冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎來(lái)制備急性心肌梗死模型,剩余15只在相同部位只穿線不結(jié)扎做為假手術(shù)處理。從模型成功且存活的大鼠中隨機(jī)挑出10只做為模型組,再?gòu)募偈中g(shù)成功且存活的大鼠中隨機(jī)挑出10只做為假手術(shù)組。術(shù)后4周,血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)兩組大鼠心功能,HE染色及Masson染色觀察兩組大鼠心肌組織病理學(xué)變化和心肌纖維化程度。2.基因芯片實(shí)驗(yàn)分別從模型組和假手術(shù)組中隨機(jī)挑選3只大鼠的心肌組織樣本來(lái)進(jìn)行基因芯片實(shí)驗(yàn)。提取模型組大鼠心臟梗死區(qū)心肌組織的總RNAs和假手術(shù)組相同部位心肌組織的總RNAs,純化、檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量。合成c DNA后進(jìn)行芯片雜交實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行芯片圖像掃描并使用Agilent Gene Spring GX V11.5軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異性分析。使用箱線圖對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。用差異比較分析、差異聚類(lèi)分析、散點(diǎn)圖、火山圖的方法對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行分析得到差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs的匯總信息。使用KOBAS 3.0對(duì)差異的mRNAs進(jìn)行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析。利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建lncRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果:1.對(duì)心功能的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠左室收縮壓(LVSP)和左室壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明顯下降(P0.01),左室舒張末壓(LVEDP)明顯上升(P0.01)。2.HE和Massson染色結(jié)果HE染色顯示模型組心肌組織中出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞壞死,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常;Masson染色顯示模型組大鼠心肌膠原纖維相比假手術(shù)組明顯增多形成片狀,假手術(shù)組大鼠膠原纖維散在分布。3.芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估通過(guò)箱線圖對(duì)芯片數(shù)據(jù)分析,樣本數(shù)據(jù)相似性好,芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。4.差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs與假手術(shù)組相比,差異表達(dá)的lncRNAs為74條,占檢測(cè)總lncRNAs探針的0.402%。其中上調(diào)的有50條,下調(diào)的有24條。2.5倍以上變化的共31個(gè),其中上調(diào)22個(gè),下調(diào)9個(gè);5倍以上變化的共2個(gè),其表達(dá)是上調(diào)的。差異表達(dá)的mRNAs為116條,占檢測(cè)總mRNAs探針的0.44%。其中上調(diào)的有99條,下調(diào)的有17條。5.差異mRNAs的功能途徑分類(lèi):GO分析以P0.05為閾值,顯著富集有693個(gè)。其中前50個(gè)中與心梗后心室重構(gòu)可能相關(guān)的有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。KEGG和PANTHER途徑分析以P0.05為閾值,得到途徑有42個(gè),與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)的生物途徑有:Rap1 signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1 signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。6.lncRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖15.A是由74個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和116個(gè)差異表達(dá)的mRNAs的構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)總圖。圖A共有174個(gè)節(jié)點(diǎn),1975個(gè)邊。B、C、D圖是A的有顯著相關(guān)性的子節(jié)點(diǎn)圖。7.研究目的lnRNAs的確定通過(guò)挖掘lncRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖,子節(jié)點(diǎn)圖關(guān)聯(lián)mRNAs的功能分析及基因位點(diǎn)分析后,最終確定3條上調(diào)lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004;3條下調(diào)lncRNAs:NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。結(jié)論:1.與假手術(shù)組相比,心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異性表達(dá)的lncRNAs有74條和mRNAs有116條。2.使用KOBAS 3.0平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析后,發(fā)現(xiàn)與心梗后心室重構(gòu)可能相關(guān)的功能有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。與其相關(guān)的途徑有:Rap1signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。3.通過(guò)對(duì)lncRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖的分析,子節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)mRNAs的功能分析及基因位點(diǎn)分析,最終篩選出6條候選lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004、NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。這6條lncRNAs將在心梗后心室重構(gòu)大鼠模型中進(jìn)行驗(yàn)證并在其后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行功能和機(jī)制研究。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R542.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2647145