【摘要】：世界衛(wèi)生組織報告,冠心病已成為全球首位的死亡原因。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心肌嚴重而持久地急性缺血引起的心肌細胞死亡。心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR)是指心肌梗死后在血流動力學、神經(jīng)體液等因素綜合作用下,心臟從基因到結(jié)構(gòu)發(fā)生改建,代謝和功能發(fā)生改變的過程。VR是急性心肌梗死后最終發(fā)展為心力衰竭(heart failure,HF)的基本病理過程,是影響急性心肌梗死預后的主要原因。因此,如何減緩或者逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死后的VR,預防HF的發(fā)生,是心肌梗死二級預防面臨的重大難題。長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNA,lncRNAs)是一類長度超過200nt的轉(zhuǎn)錄本,其本身不能編碼蛋白。起初它被認為不具有生物學功能,然而,研究表明lncRNAs具有廣泛的生物學功能,它們以RNA形式在多種層面上調(diào)控基因表達水平。為探討復雜疾病的病理機制提供一個新的研究領域。本實驗是通過基因芯片實驗來篩選心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異表達的lncRNAs,以此為基礎期望能夠發(fā)現(xiàn)心室重構(gòu)特異lncRNA的靶標基因,為心室重構(gòu)提供新的診斷依據(jù)和防治手段。目的:篩選心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異性表達的lncRNAs和mRNAs,并通過生物信息學分析技術(shù)對差異表達的mRNAs進行功能、途徑富集和lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建,以期找到與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)的靶標基因。方法:1.大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)模型制備60只健康SPF級雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,體質(zhì)量(200±20)g基礎飼料適應性喂養(yǎng)一周后,隨機選取45只大鼠在左冠狀動脈前降支進行結(jié)扎來制備急性心肌梗死模型,剩余15只在相同部位只穿線不結(jié)扎做為假手術(shù)處理。從模型成功且存活的大鼠中隨機挑出10只做為模型組,再從假手術(shù)成功且存活的大鼠中隨機挑出10只做為假手術(shù)組。術(shù)后4周,血流動力學檢測兩組大鼠心功能,HE染色及Masson染色觀察兩組大鼠心肌組織病理學變化和心肌纖維化程度。2.基因芯片實驗分別從模型組和假手術(shù)組中隨機挑選3只大鼠的心肌組織樣本來進行基因芯片實驗。提取模型組大鼠心臟梗死區(qū)心肌組織的總RNAs和假手術(shù)組相同部位心肌組織的總RNAs,純化、檢驗RNA的質(zhì)量。合成c DNA后進行芯片雜交實驗。進行芯片圖像掃描并使用Agilent Gene Spring GX V11.5軟件對芯片數(shù)據(jù)進行歸一化和差異性分析。使用箱線圖對芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估。用差異比較分析、差異聚類分析、散點圖、火山圖的方法對差異表達的lncRNAs和mRNAs進行分析得到差異表達的lncRNAs和mRNAs的匯總信息。使用KOBAS 3.0對差異的mRNAs進行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析。利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡。結(jié)果:1.對心功能的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠左室收縮壓(LVSP)和左室壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)明顯下降(P0.01),左室舒張末壓(LVEDP)明顯上升(P0.01)。2.HE和Massson染色結(jié)果HE染色顯示模型組心肌組織中出現(xiàn)大量心肌細胞壞死,假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)正常;Masson染色顯示模型組大鼠心肌膠原纖維相比假手術(shù)組明顯增多形成片狀,假手術(shù)組大鼠膠原纖維散在分布。3.芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量評估通過箱線圖對芯片數(shù)據(jù)分析,樣本數(shù)據(jù)相似性好,芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。4.差異表達的lncRNAs和mRNAs與假手術(shù)組相比,差異表達的lncRNAs為74條,占檢測總lncRNAs探針的0.402%。其中上調(diào)的有50條,下調(diào)的有24條。2.5倍以上變化的共31個,其中上調(diào)22個,下調(diào)9個;5倍以上變化的共2個,其表達是上調(diào)的。差異表達的mRNAs為116條,占檢測總mRNAs探針的0.44%。其中上調(diào)的有99條,下調(diào)的有17條。5.差異mRNAs的功能途徑分類:GO分析以P0.05為閾值,顯著富集有693個。其中前50個中與心梗后心室重構(gòu)可能相關(guān)的有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。KEGG和PANTHER途徑分析以P0.05為閾值,得到途徑有42個,與心梗后心室重構(gòu)相關(guān)的生物途徑有:Rap1 signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1 signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。6.lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡圖15.A是由74個差異表達的lncRNAs和116個差異表達的mRNAs的構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡總圖。圖A共有174個節(jié)點,1975個邊。B、C、D圖是A的有顯著相關(guān)性的子節(jié)點圖。7.研究目的lnRNAs的確定通過挖掘lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡圖,子節(jié)點圖關(guān)聯(lián)mRNAs的功能分析及基因位點分析后,最終確定3條上調(diào)lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004;3條下調(diào)lncRNAs:NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。結(jié)論:1.與假手術(shù)組相比,心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織中差異性表達的lncRNAs有74條和mRNAs有116條。2.使用KOBAS 3.0平臺對差異表達的mRNAs進行GO功能分析、KEGG和PANTHER pathwy分析后,發(fā)現(xiàn)與心梗后心室重構(gòu)可能相關(guān)的功能有:cell surface receptor signaling pathway,immune system process,positive regulation of cytokine production,response to stimulus,regulation of cytokine production,cytokine production。與其相關(guān)的途徑有:Rap1signaling pathway,Cytokine-cytokine receptor interaction,Ras signaling pathway,NF-kappa B signaling pathway,MAPK signaling pathway,HIF-1signaling pathway,Inflammatory mediator regulation of TRP channels。3.通過對lncRNAs-mRNAs共表達網(wǎng)絡圖的分析,子節(jié)點關(guān)聯(lián)mRNAs的功能分析及基因位點分析,最終篩選出6條候選lncRNAs:LOC103691864、NONRATT015650、NONRATT031004、NONRATT025704、LOC102552965、NONRATT012533。這6條lncRNAs將在心梗后心室重構(gòu)大鼠模型中進行驗證并在其后續(xù)實驗中進行功能和機制研究。
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R542.22

【參考文獻】

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