【摘要】：研究背景:腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)在我國(guó)老年人群中常見,發(fā)生動(dòng)脈瘤破裂常致患者猝死。目前對(duì)AAA的治療手段主要還是開放手術(shù)和介入治療。然而這兩種治療手段均有其相應(yīng)的局限性,對(duì)于老年患者及早期患者均不能完全適用。因此深入探索AAA發(fā)生機(jī)制,對(duì)于尋找診斷和治療的新靶點(diǎn),實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期預(yù)防、早期藥物治療,具有重要意義。目前AAA的機(jī)制研究已經(jīng)做了大量工作并碩果累累,但目前仍沒有有效的藥物應(yīng)用于臨床治療。類似于動(dòng)脈粥樣硬化,慢性炎癥反應(yīng)是AAA重要機(jī)制,肥大細(xì)胞(mast cell,MC)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)導(dǎo)致的動(dòng)脈壁炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解在AAA該過(guò)程中起重要作用。文獻(xiàn)提示Meprin-α(Mep1A基因表達(dá))作為金屬內(nèi)肽酶,通過(guò)改變蛋白質(zhì)和炎癥因子活性,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病中扮演著重要角色。主動(dòng)脈壁中的Meprin A可以分解血管活性肽,也可激活炎性細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥,并且最終加速ECM的降解并促進(jìn)血管重塑。如抑制或敲除Meprin A可能會(huì)減弱動(dòng)脈壁炎癥,抑制主動(dòng)脈管壁的重塑。在上述研究報(bào)道的基礎(chǔ)上,我們推測(cè)如將小鼠的MeplA基因敲除,其炎癥反應(yīng)應(yīng)該顯著降低,小鼠AAA的形成和進(jìn)展也將受到抑制。目的:研究Mep1A基因通過(guò)炎癥機(jī)制在AAA形成和破裂過(guò)程中的作用及機(jī)制。研究方法:(1)人體標(biāo)本檢測(cè):收集AAA患者動(dòng)脈瘤壁組織和正常成人的主動(dòng)脈壁組織,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織標(biāo)本中Meprin-α的表達(dá)是否不同。收集正常人和AAA患者的血清標(biāo)本,檢測(cè)正常人、AAA患者經(jīng)他汀類藥物治療和未經(jīng)他汀類藥物治療等情形下血清炎癥因子,比較其不同;檢測(cè)AAA患者經(jīng)他汀類藥物治療前后炎癥因子的變化情況。本步驟揭示Meprin-α和炎癥因子在人體AAA發(fā)病機(jī)制中的重要作用。(2)小鼠的培養(yǎng)和AAA模型的建立:使用Apoe-/-Mep1A-/-小鼠及其同窩的Apoe-/-Mep1A+/+小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照,實(shí)驗(yàn)前和取材前均測(cè)量體重和血壓,通過(guò)皮下置入含有血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)微型滲透泵的方法誘導(dǎo)AAA形成。(3)小鼠主動(dòng)脈組織免疫組織化學(xué)分析:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法,對(duì)小鼠動(dòng)脈瘤壁組織和主動(dòng)脈壁組織中巨噬細(xì)胞(Mac-3),T細(xì)胞(CD4),肥大細(xì)胞(CD117),主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ),MCP-1,彈力蛋白,CD31,TUNEL和Mep1A,TNF-α等進(jìn)行免疫染色。通過(guò)測(cè)量免疫組化染色信號(hào)的陽(yáng)性面積來(lái)量化主動(dòng)脈組織中的巨噬細(xì)胞和MCP-1的相對(duì)含量。病灶中CD31+的微血管和CD4+T細(xì)胞用每平方毫米的數(shù)量來(lái)進(jìn)行定量。將彈力蛋白的降解程度根據(jù)Deckert等報(bào)道的分級(jí)要點(diǎn)進(jìn)行分級(jí)。(4)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):使用Trizol試劑從AAA組織提取總細(xì)胞RNA。然后用無(wú)RNA酶的DNA酶處理RNA樣品以去除基因組DNA污染物。反轉(zhuǎn)錄等量的RNA,并在單色實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行定量PCR。將TNF-α和Mep1 A的mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因——GAPDH的mRNA水平。(5)Western Blot分析:主動(dòng)脈組織或細(xì)胞在裂解緩沖液中提取蛋白。將等量的蛋白質(zhì)提取物加載到8%或12%SDS-PAGE凝膠上,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并用山羊抗兔Mep1 A多克隆抗體,山羊抗兔TNF-α多克隆抗體檢測(cè)相應(yīng)蛋白。同時(shí)應(yīng)用持家蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的進(jìn)行免疫印跡以確保相等的蛋白質(zhì)加載量。本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也應(yīng)用Western Blot對(duì)IgE刺激MCs后產(chǎn)物中的信號(hào)分子進(jìn)行了檢測(cè)。(6)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA):使用ELISA試劑盒對(duì)Apoe-/-Mep1A+/+和Apoe-/-Mep1A-/-小鼠血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中測(cè)定血漿中的TNF-α水平。用0.5mmol/L的H2SO4終止反應(yīng)并在450nm讀取吸光度。使用Graphpad Prism 5.0圖形軟件包計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定目標(biāo)基因濃度。(7)細(xì)胞培養(yǎng)和小干擾RNA(siRNA)干預(yù):根據(jù)制造商的方案,將培養(yǎng)的肥大細(xì)胞應(yīng)用Mep1A的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。生長(zhǎng)24小時(shí)后將粘附80%的細(xì)胞徹底洗滌并收獲。研究結(jié)果:1.使用免疫組織化學(xué)染色在人AAA組織和AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠AAA組織中發(fā)現(xiàn)Mep1A的表達(dá)增加。2.Ang Ⅱ誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠成功的建立了 AAA動(dòng)物模型。3.Mep1A缺陷提高了 AAA小鼠的存活率。4.病理分析顯示Mep1A的缺失降低了 AAA組織中的彈力層的降解和VSMC凋亡。5.通過(guò)rt-PCR,WestemBlot和ELISA等方法,在體外機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),Mep1A主要在肥大細(xì)胞(MCs)中表達(dá),并介導(dǎo)TNF-α的表達(dá)。6.MCs分泌的TNF-α促進(jìn)VSMCs中MMPs的表達(dá),促進(jìn)VSMC凋亡。7.在人體血清標(biāo)本中證實(shí),AAA患者血清中Meprin-α和TNF-α也表達(dá)增加,而經(jīng)過(guò)他汀類藥物短期治療后,炎癥因子TNF-α顯著降低。8.總體來(lái)說(shuō),本研究發(fā)現(xiàn)Mep1A在肥大細(xì)胞中通過(guò)分泌TNF-α介導(dǎo)AAA破裂,其促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表達(dá)和促進(jìn)彈性蛋白降解的細(xì)胞凋亡。結(jié)論:綜合起來(lái),我們的研究數(shù)據(jù)表明Mep1A在MC中表達(dá)量調(diào)高,可通過(guò)介導(dǎo)MC中TNF-α的分泌,而促進(jìn)VSMC中MMPs的表達(dá)和中層彈力蛋白的降解,以及促進(jìn)VSMC的凋亡,從而在AAA發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。敲除Mep1A顯著提高了小鼠AAA的穩(wěn)定性并降低了小鼠死亡率。因此,Mep1A可能成為降低AAA死亡率的新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

邋ＷＴ）＋鹽水組：Ａｐｏｅ＿Ａ邋ＭｅｐｌＡ＋／＋（邋ＷＴ）小鼠，以鹽水栗進(jìn)行假手術(shù)；②ＷＴ＋ＡｎｇＩＩ逡逑組：Ａｐｏｅｖ＿ＭｅｐｌＡ＋／＋邋（ＷＴ）小鼠，用邋Ａｎｇｌｌ邋處理；③敲除型（ｋｎｏｃｋｏｕｔ，邋ＫＯ）邋＋ＡｎｇＩＩ逡逑組：ＡｐｏｅｉＭｅｐｌＡ－ｚ—邋（Ｋ０）小鼠，用Ａｎｇｌｌ處理。如圖１Ａ和１Ｂ所示，三組動(dòng)物逡逑標(biāo)本取材后經(jīng)Ｍｅｐｒｉｎ－ａ免疫組化染色，提示ＭｅｐｌＡ在Ａｎｇｌｌ處理后的ＷＴ小鼠的逡逑血管中高度表達(dá)，而在未經(jīng)Ａｎｇｌｌ處理的小鼠和在Ｍｅｐｌ敲除（Ｋ０）小鼠主動(dòng)脈中逡逑但中表達(dá)不高。提示①Ａｎｇｌｌ誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈表達(dá)ＭｅｐｌＡ增加；②本實(shí)驗(yàn)中ＭｅｐｌＡ逡逑敲除成功。逡逑ＭｅｐｌＡ免疫組化染色逡逑Ａ逡逑，：巧灌衡：：：３逡逑Ａｐｏｅ．ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋邐Ａｐｏｅ＿／＊Ｍｅｐ１邋Ａ＋／＋＋Ａｎｇ邋１１邐Ａｐｏｅ＇ＡＭｅｐ邋１邋Ａ＇Ａ＋Ａｎｇ邋１１逡逑Ｂ邋一一，邐—邐邐—邋ａ邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋逡逑ｇ邋Ｓ邐□邋Ａｐｏｅ＊ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋＋Ａｎｇｌｌ逡逑ｃ邋＾邋４－邐￣￣｜邐■邋ＡｐｏｅＡＭ印邋１Ａ．Ａ＋Ａｎｇｌｌ逡逑Ｏ邋＞逡逑＜＾２逡逑－ｒ－逡逑＾逡逑圖１．邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ組織中的表達(dá)。（Ａ）邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ組織中的免疫逡逑組織化學(xué)。（Ｂ）條形圖顯示小鼠中ＭｅｐｌＡ陽(yáng)性區(qū)域的百分比。＊示逡逑Ａｐｏｅ－／－ＭｅｐｌＡ＋／＋＋Ａｎｇ邋ＩＩ邋組ＭｅｐｌＡ邋的表達(dá)量高于邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐｌＡ＋／＋組，Ｐ＜０．０５，即邋Ａｎｇｌｌ逡逑刺激主動(dòng)脈壁邋Ｍｅｐｌ邋Ａ邋表達(dá)增加（ｔ＝２．６４２

我們接下來(lái)就測(cè)試了邋ＭＭＰｓ是否參與了邋ＭｅｐｌＡ介導(dǎo)的ＡＡＡ形成。小鼠主動(dòng)逡逑脈的免疫組化染色數(shù)據(jù)顯示，，與ＷＴ小鼠相比，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠中ＭＭＰ２和ＭＭＰ９逡逑的表達(dá)顯著降低（圖３Ｂ和３Ｃ）。同時(shí)，ＲＴ－ＰＣＲ的結(jié)果顯示，ＡＡＡ組織中ＭＭＰ２逡逑和ＭＭＰ９的ｍＲＮＡ水平反映了染色結(jié)果（圖３Ｄ）。由于細(xì)胞凋亡對(duì)于血管壁的病逡逑理性重構(gòu)也是至關(guān)重要的，所以我們還檢測(cè)了模型小鼠主動(dòng)脈壁中的細(xì)胞凋亡情逡逑況。在我們對(duì)小鼠主動(dòng)脈壁ＴＵＮＥＬ染色的統(tǒng)計(jì)中，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠的ＡＡＡ組織中逡逑細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性率（２．３５％）顯著低于ＷＴ小鼠（６．８７％）（圖３Ｅ）。這些數(shù)據(jù)表明逡逑ＭｅｐｌＡ缺陷可能通過(guò)降低彈性蛋白的降解和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制ＡＡＡ破裂。逡逑３６逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.16

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本文編號(hào)：2646886