【摘要】：【研究背景】肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種致命的進(jìn)行性疾病,其主要病理特征為肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力的進(jìn)行性升高,從而發(fā)展為右心室肥厚,右心衰竭甚至死亡。目前國(guó)際上認(rèn)可的肺動(dòng)脈高壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:在海平面海拔高度、靜息狀態(tài)下,右心導(dǎo)管檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥20mm Hg。肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,致死致殘率高。血管周?chē)难装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的異常增殖、血管內(nèi)皮功能障礙是PH的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。盡管目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制及治療已有一定研究進(jìn)展,也有許多治療方式可供選擇以改善患者的癥狀,但目前的治療藥物及方法無(wú)法改善疾病的危害及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)存在于體內(nèi)多種組織細(xì)胞中,包括骨髓、臍帶血和脂肪組織等。因其在傷口愈合、組織修復(fù)、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮特異性作用,成為許多疾病的理想治療靶點(diǎn)。近年來(lái)干細(xì)胞治療在心梗、腦缺血、腫瘤等疾病治療實(shí)現(xiàn)了突破性進(jìn)展。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究,干細(xì)胞療法已被證實(shí)在野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠PH模型中是有效的,提示MSC有可能成為臨床上治療肺動(dòng)脈高壓的新策略,但其具體的作用機(jī)制目前仍不明確,有待進(jìn)一步研究�！狙芯磕康摹勘狙芯吭隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)追蹤標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)移植后在肺組織內(nèi)的定位、分布及分化情況,并評(píng)估BMSC對(duì)慢性低氧致肺動(dòng)脈高壓(chronic hypoxia induced-PH,CHPH)和Sugen+低氧致肺動(dòng)脈高壓(sugen-hypoxia induced-PH,SuHx-PH)兩種模型的治療作用,檢測(cè)BMSC是否影響了血管周?chē)z原沉積及內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndoMT)的過(guò)程。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們將BMSC與PASMC進(jìn)行共培養(yǎng),觀測(cè)它對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PASMC增殖及凋亡的影響,我們還用BMSC條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC)進(jìn)行處理,以研究BMSC-CM是否可以通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能對(duì)PH起治療作用�！狙芯糠椒ā�1.建立CHPH及SuHx-PH動(dòng)物模型,(1)利用慢病毒轉(zhuǎn)染GFP對(duì)BMSC進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)免疫熒光染色觀測(cè)BMSC移植后在肺組織內(nèi)的分布及分化情況;(2)通過(guò)觀察大鼠的血流動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)指標(biāo),評(píng)價(jià)BMSC對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治療作用;(3)通過(guò)Masson染色檢測(cè)血管周?chē)z原沉積情況、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法檢測(cè)大鼠肺組織Col I、Col III的mRNA表達(dá)變化、免疫組化染色和蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot,WB)法檢測(cè)大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)變化;(4)通過(guò)免疫熒光雙染和WB檢測(cè)內(nèi)皮及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的變化;2.原代培養(yǎng)PAMSC和PMVEC,與BMSC或BMSC-CM共培養(yǎng),(1)應(yīng)用Edu染色法和Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)PASMC的增殖與凋亡情況;(2)應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀測(cè)PMVEC的細(xì)胞形態(tài);(3)通過(guò)WB檢測(cè)PMVEC中內(nèi)皮及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的變化;(4)通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSC-CM對(duì)PMVEC遷移的影響�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.BMSC移植后可在正常大鼠的肺組織內(nèi)停留,并在缺氧模型組大鼠的肺組織內(nèi)歸巢。2.BMSC治療明顯改善CHPH及SuHx-PH模型大鼠的右心室收縮壓、右心肥厚指數(shù)以及肺血管重塑。3.BMSC治療降低CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺血管周?chē)z原沉積以及Col I、ColⅢ、MMP2、MMP9的表達(dá)。4.BMSC治療降低CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺組織中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),升高內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),抑制CHPH及SuHx-PH模型大鼠肺血管的Endo MT。5.BMSC共培養(yǎng)對(duì)低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMC的增殖與凋亡情況無(wú)明顯影響。6.BMSC-CM處理減輕低氧誘導(dǎo)的大鼠PMVEC的EndoMT及遷移�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)論】BMSC對(duì)CHPH及SuHx-PH模型大鼠具有治療作用,且這種治療作用可能是通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子抑制膠原沉積和EndoMT途徑來(lái)達(dá)成的。
【圖文】：

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果1. BMSC 移植后在 SD 大鼠肺組織內(nèi)的歸巢情況為了確定 BMSC 移植后在 SD 大鼠肺組織內(nèi)的歸巢情況，我們用 GFP 通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì) BMSC 進(jìn)行標(biāo)記，并且尾靜脈注射后第 3 小時(shí)、1 天、3 天、7 天、14天處死大鼠，，進(jìn)行肺組織免疫熒光染色。結(jié)果如圖 1-1 所示，在移植 BMSC 后第 7天（18.2 個(gè)細(xì)胞/高倍鏡視野）肺組織內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到峰值，并在第 14 天（9.8個(gè)細(xì)胞/每高倍鏡視野）逐漸減少。注射生理鹽水的對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。如圖 1-2示，與常氧組相比，CHPH 組大鼠肺組織內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目較多，在第 7 和 14 天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖 1-2：BMSC 移植后在 SD 大鼠肺組織每高倍鏡視野下的陽(yáng)性細(xì)胞**P＜0.01 vs 常氧組，***P＜0.001 vs 常氧組；Nor、CH、h、d：同 移植后在 SD 大鼠肺組織內(nèi)的分布與分化情況證 BMSC 移植后在 SD 大鼠肺組織內(nèi)的分布與分化情況，我 7 天后的肺組織進(jìn)行了 GFP（綠色）和 vWF（紅色）的熒 所示，我們發(fā)現(xiàn) BMSC 移植后，陽(yáng)性細(xì)胞均勻地分布于肺組內(nèi)皮細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1

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本文編號(hào)：2646757