發(fā)布時間：2020-04-30 22:15

【摘要】：第1章引言肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是多因素參與發(fā)生發(fā)展的高死亡率心血管疾病,肺移植(Lung transplantation)或心肺聯(lián)合移植(Heart-lung transplantation)是PAH終末期患者唯一有效的治療策略�；诖�,深入探討PAH的發(fā)病機制,為PAH的治療尋找新的切入點是本領域研究的重要任務。新近研究表明,PAH與癌癥發(fā)生(Carcinogenesis)在病理生理和發(fā)病機制上有諸多相似之處,如細胞過度增殖(Hyperproliferation)和凋亡耐受(Apoptotic resistance),代謝重編(Metabolic reprogramming)等。本研究以野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導的大鼠肺動脈高壓為模型,圍繞核受體結合SET結構域2(Nuclear receptor binding SET domain 2,NSD2)及其調控的組蛋白賴氨酸甲基化(尤其是H3K36)情況,檢測NSD2表達和組蛋白甲基化水平,利用腺相關病毒(Adeno-associate virus,AAV)介導的NSD2沉默,下調NSD2的蛋白表達；采用心臟超聲(Echocardiography)和右心微導管(Right ventricular microcatheter)檢測心臟功能,同時采用右心微導管檢測肺動脈血壓變化；利用組織病理學檢測肺動脈管壁和右心室心肌的病理改變,以及免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢測NSD2的表達定位,探討NSD2和組蛋白甲基化在大鼠PAH中對肺動脈血壓、肺動脈重塑、右心室功能和右心室肥厚的影響作用。利用氣相色譜-質譜(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析大鼠肺組織差異性代謝產物,通過組內比較篩選出差異最明顯的代謝產物。并進一步利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析和網狀分析(Network analysis),探討該代謝產物的生物功能及其在PAH的可能作用。最后,利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量測序技術檢測PAH組內差異性表達的mRNA；利用基因本體論(Gene ontology,GO)分別從細胞定位(Cellular component,CC)、分子功能(Molecualr function,MF)和生物過程(Biological process,BP)三個角度分析差異性表達基因的富集情況；利用KEGG通路分析探討差異性表達基因在信號轉導通路中的富集情況；利用聚類分析(Clustering analysis),以熱圖(Heat map)形式篩選可能參與調控PAH的NSD2下游靶基因,為今后驗證NSD2在PAH中的調控靶基因及其機制做好準備。為此,本研究以NSD2介導H3K36甲基化為切入點,以代謝組學技術和二代高通量測序技術為支持,圍繞NSD2調控代謝重編促進細胞增殖和凋亡耐受促發(fā)肺動脈和右心室惡性重構,逐步揭示PAH的發(fā)生發(fā)展機制,為PAH的預防和治療策略研究提供實驗證據(jù),為相關藥物的研發(fā)提供思路。第2章NSD2在PAH中的作用及其調控機制目的:探討在野百合堿誘導的大鼠PAH模型中,下調NSD2表達對肺動脈壓、右心室功能的影響；探討下調NSD2表達對肺動脈及右心室重構的影響；明確NSD2在肺動脈中的表達定位；驗證NSD2對組蛋白賴氨酸的甲基化作用；探討下調NSD2表達對代謝相關因子表達的影響。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關病毒(AAV)建立NSD2.干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對照)下調NSD2表達,以重組病毒感染H9C2細胞后檢測NSD2 mRNA評價沉默效果,重組病毒(5×1012)經尾靜脈注射感染大鼠；實驗分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即AAV-shNSD2和MCT注射組；shNSD2Sham組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后以右心導管測量肺循環(huán)血壓；左頸動脈導管測量體循環(huán)血壓；心臟超聲心動圖檢測右心功能和右心肥大；收取肺組織,用于制作組織切片、提取總蛋白和總RNA；以組織學評價肺動脈和右心室重構；采用免疫熒光共聚焦檢測NSD2在肺動脈中的表達定位；以實時定量PCR(RT-qPCR)檢測代謝相關因子的mRNA表達。結果:(1)成功構建AAV-shNSD2重組病毒:AAV-shNSD2轉染H9C2后,NSD2的mRNA表達顯著下調。(2)AAV-shNSD2成功感染大鼠:NSD2蛋白表達顯著下降。(3)MCT 成功誘導大鼠 PAH(NullMCrvs NullSham；shNSD2MCT VS shNSD2Sham):右心室平均壓力(RVMP)、右心室收縮期壓力(RVSP)、肺動脈平均壓(mPAP)、全肺阻力(TPR)明顯升高；右心排量(RVCO)顯著降低；體循環(huán)動脈壓(SBP)和體循環(huán)平均動脈壓(mSAP)無特異改變；下調NSD2表達顯著緩解PAH(shNSD2MCT VS NullMCT):RVMP、RVSP、mPAP、TPR明顯降低,RVCO顯著升高。(4)MCT促發(fā)PAH致右心室重構和右心功能減退(NullMCT VS NullSham；shNSD2MCTvs shNSD2Sham):右室舒張末期內徑(RVEDD)、右心室舒張末期容積(RVEDV)、右室收縮末期內徑(RVESD)、右心室收縮末期容積(RVESV)、右心室后壁厚度(RVPWT)、室間隔厚度(IVST)明顯升高；右室射血分數(shù)(RVEF)、右室縮短分數(shù)(RVFS)、RR間期校正肺動脈血流加速時間(PAAT/CL)顯著降低；下調NSD2表達顯著抑制右心室重構、改善右心功能(shNSD2MCTvs Null MCT):RVEDD、RVEDV、RVESD、RVESV、RVPWT、IVST明顯升高,RVEF、RVFS、PAAT/CL顯著降低。(5)MCT誘導肺動脈中膜增厚和右心室惡性重構(NullMCTvs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham):肺動脈相對厚度(PAMT%)、右心室質量與體重比(RV/BW)、右心室與左心室+室間隔質量比[RV/(LV+S)]明顯升高；下調NSD2表達可部分逆轉肺動脈中膜增厚和右心室惡性重構(shNSD2MCT vs NullMCT):PAMT%、RV/BW和RV/(LV+S)顯著降低。(6)MCT誘導的PAH可見H3K36二甲基化(H3K36me2)水平升高(NullMCT vs Null Sham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下調 NSD2 表達可下調 H3K36me2(shNSD2MCT vs NullMCT)。(7)NSD2主要表達于肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)和肺動脈內皮細胞(PAECs)中。(8)MCT誘導的PAH可見葡萄糖轉運體1(Glutl)和丙酮酸脫氫酶(PDH)表達降低(NullMCT vs Null Sham;shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；乳酸脫氫酶(LDH)、肉毒堿棕櫚�；D移酶1(CPT1)和含氧酸輔酶 A 轉移酶 1(OXCT1)表達升高(NullMCT vs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下調NSD2表達可下調OXCT1表達(shNSD2MCT vs NullMCT)。結論:NSD2通過催化H3K36二甲基化,參與PAH發(fā)生發(fā)展,而下調NSD2表達可抑制PAH的發(fā)生發(fā)展。第3章NSD2調控PAH的代謝組學分析目的:篩選PAH組內差異性代謝產物,探討差異性代謝產物的調控功能和在PAH中的可能作用。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關病毒(AAV)建立NSD2干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對照)下調NSD2表達,以重組病毒感染H9C2細胞后檢測NSD2 mRNA評價沉默效果,重組病毒(5×1012)經尾靜脈注射感染大鼠；實驗分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即 AAV-shNSD2 和 MCT注射組；shNSD2Sham組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后收取肺組織,提取代謝產物和總蛋白；利用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析不同組別大鼠肺組織差異性代謝產物,并篩選出與NSD2表達下調有關的代謝產物；利用KEGG代謝通路富集分析和網狀分析,探討該代謝產物在信號通路中的功能及其在PAH的可能作用。利用Western blot檢測白噬相關蛋白的表達。結果:(1)MCT誘導的大鼠PAH可見肺組織內11種代謝產物升高(NullMCT vs Null Sham)；下調NSD2表達后,該11中產物中唯有海藻糖下降(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Shsm vs Null Sham)。(2)海藻糖主要參與的通路包括:ABC轉運器、礦物吸收、蛋白消化與吸收、代謝通路、氨�；�-tRNA生物合成、突觸囊泡循環(huán)、氨基酸合成、氰基氨基酸代謝、植物次生代謝產物生物合成和乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。(3)海藻糖參與PAH可能是通過ABC轉運器和代謝通路發(fā)揮作用。(4)下調NSD2表達后,促自噬因子LC3-Ⅱ,Beclin1和phos-AMPK表達顯著下降,自噬抑制因子P62顯著升高。結論:NSD2可能通過調控海藻糖的代謝,以ABC轉運器和代謝通路為介導,參與PAH發(fā)生發(fā)展。海藻糖可能通過調節(jié)細胞自噬參與PAH的發(fā)生發(fā)展。第4章NSD2調控PAH的表達譜分析目的:篩選介導NSD2調控代謝重編的下游靶基因,為后續(xù)研究NSD2在PAH中的調控機制研究做準備。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關病毒(AAV)建立NSD2干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對照)下調NSD2表達,以重組病毒感染H9C2細胞后檢測NSD2 mRNA評價沉默效果,重組病毒(5×1012)經尾靜脈注射感染大鼠；實驗分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即 AAV-shNSD2 和 MCT 注射組；shNSD2Sham 組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后收取肺組織,提取總RNA；利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量測序技術檢測PAH組內差異性表達的mRNA;利用基因本體論分別從細胞定位、分子功能和生物過程三個角度分析差異性表達基因的富集情況；利用KEGG通路富集分析,探討差異性表達基因在信號轉導通路中的富集情況；利用聚類分析,以熱圖形式篩選可能參與調控PAH的NSD2下游靶基因。結果:MCT誘導的大鼠PAH可見大量mRNA表達上調的基因(NullMCT vs Null Sham),其中下調NSD2表達可引起以下代謝相關基因mRNA表達下調(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Sham vs NullSham):TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和 TXNIP表達顯著降低。結論:TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和TXNIP可能作為NSD2的下游基因,介導NSD2調控代謝重編,參與PAH發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

第 2 章 NSD2 在 PAH 中的作用及其調控機制照南昌大學動物實驗科學部和美國國立衛(wèi)生研究院的標準執(zhí)行，并已取得學實驗動物管理和使用倫理委員會審核批準。 NSD2 干擾載體構建1 腺相關病毒載體研究使用 pAAV-2xU6 載體，將目的片斷插入 XbaⅠ和 SpeⅠ區(qū)，由 U調控表達。（圖 2.2.2.1）

PCR.4。學分析用均數(shù)±標準差 ( X±SD) 表示，所獲數(shù)據(jù)采用 SP，以 P<0.05 表示有顯著性差異，，P<0.01 表示有非導 NSD2 沉默效率鑒定感染 H9C2 細胞后，抽提總 RNA，逆轉錄成 cDNARNA 相對表達，以 GAPDH mRNA 為內參，結果見hNSD2 可顯著下調 NSD2 mRNA 的表達，提示 AA。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R544.1

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