【摘要】：第1章引言肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是多因素參與發(fā)生發(fā)展的高死亡率心血管疾病,肺移植(Lung transplantation)或心肺聯(lián)合移植(Heart-lung transplantation)是PAH終末期患者唯一有效的治療策略�；诖�,深入探討PAH的發(fā)病機(jī)制,為PAH的治療尋找新的切入點(diǎn)是本領(lǐng)域研究的重要任務(wù)。新近研究表明,PAH與癌癥發(fā)生(Carcinogenesis)在病理生理和發(fā)病機(jī)制上有諸多相似之處,如細(xì)胞過度增殖(Hyperproliferation)和凋亡耐受(Apoptotic resistance),代謝重編(Metabolic reprogramming)等。本研究以野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓為模型,圍繞核受體結(jié)合SET結(jié)構(gòu)域2(Nuclear receptor binding SET domain 2,NSD2)及其調(diào)控的組蛋白賴氨酸甲基化(尤其是H3K36)情況,檢測(cè)NSD2表達(dá)和組蛋白甲基化水平,利用腺相關(guān)病毒(Adeno-associate virus,AAV)介導(dǎo)的NSD2沉默,下調(diào)NSD2的蛋白表達(dá)；采用心臟超聲(Echocardiography)和右心微導(dǎo)管(Right ventricular microcatheter)檢測(cè)心臟功能,同時(shí)采用右心微導(dǎo)管檢測(cè)肺動(dòng)脈血壓變化；利用組織病理學(xué)檢測(cè)肺動(dòng)脈管壁和右心室心肌的病理改變,以及免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢測(cè)NSD2的表達(dá)定位,探討NSD2和組蛋白甲基化在大鼠PAH中對(duì)肺動(dòng)脈血壓、肺動(dòng)脈重塑、右心室功能和右心室肥厚的影響作用。利用氣相色譜-質(zhì)譜(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析大鼠肺組織差異性代謝產(chǎn)物,通過組內(nèi)比較篩選出差異最明顯的代謝產(chǎn)物。并進(jìn)一步利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析和網(wǎng)狀分析(Network analysis),探討該代謝產(chǎn)物的生物功能及其在PAH的可能作用。最后,利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PAH組內(nèi)差異性表達(dá)的mRNA；利用基因本體論(Gene ontology,GO)分別從細(xì)胞定位(Cellular component,CC)、分子功能(Molecualr function,MF)和生物過程(Biological process,BP)三個(gè)角度分析差異性表達(dá)基因的富集情況；利用KEGG通路分析探討差異性表達(dá)基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的富集情況；利用聚類分析(Clustering analysis),以熱圖(Heat map)形式篩選可能參與調(diào)控PAH的NSD2下游靶基因,為今后驗(yàn)證NSD2在PAH中的調(diào)控靶基因及其機(jī)制做好準(zhǔn)備。為此,本研究以NSD2介導(dǎo)H3K36甲基化為切入點(diǎn),以代謝組學(xué)技術(shù)和二代高通量測(cè)序技術(shù)為支持,圍繞NSD2調(diào)控代謝重編促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡耐受促發(fā)肺動(dòng)脈和右心室惡性重構(gòu),逐步揭示PAH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為PAH的預(yù)防和治療策略研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),為相關(guān)藥物的研發(fā)提供思路。第2章NSD2在PAH中的作用及其調(diào)控機(jī)制目的:探討在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中,下調(diào)NSD2表達(dá)對(duì)肺動(dòng)脈壓、右心室功能的影響；探討下調(diào)NSD2表達(dá)對(duì)肺動(dòng)脈及右心室重構(gòu)的影響；明確NSD2在肺動(dòng)脈中的表達(dá)定位；驗(yàn)證NSD2對(duì)組蛋白賴氨酸的甲基化作用；探討下調(diào)NSD2表達(dá)對(duì)代謝相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對(duì)照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關(guān)病毒(AAV)建立NSD2.干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對(duì)照)下調(diào)NSD2表達(dá),以重組病毒感染H9C2細(xì)胞后檢測(cè)NSD2 mRNA評(píng)價(jià)沉默效果,重組病毒(5×1012)經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠；實(shí)驗(yàn)分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即AAV-shNSD2和MCT注射組；shNSD2Sham組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后以右心導(dǎo)管測(cè)量肺循環(huán)血壓；左頸動(dòng)脈導(dǎo)管測(cè)量體循環(huán)血壓；心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)右心功能和右心肥大；收取肺組織,用于制作組織切片、提取總蛋白和總RNA；以組織學(xué)評(píng)價(jià)肺動(dòng)脈和右心室重構(gòu)；采用免疫熒光共聚焦檢測(cè)NSD2在肺動(dòng)脈中的表達(dá)定位；以實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)代謝相關(guān)因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建AAV-shNSD2重組病毒:AAV-shNSD2轉(zhuǎn)染H9C2后,NSD2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。(2)AAV-shNSD2成功感染大鼠:NSD2蛋白表達(dá)顯著下降。(3)MCT 成功誘導(dǎo)大鼠 PAH(NullMCrvs NullSham；shNSD2MCT VS shNSD2Sham):右心室平均壓力(RVMP)、右心室收縮期壓力(RVSP)、肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)、全肺阻力(TPR)明顯升高；右心排量(RVCO)顯著降低；體循環(huán)動(dòng)脈壓(SBP)和體循環(huán)平均動(dòng)脈壓(mSAP)無特異改變；下調(diào)NSD2表達(dá)顯著緩解PAH(shNSD2MCT VS NullMCT):RVMP、RVSP、mPAP、TPR明顯降低,RVCO顯著升高。(4)MCT促發(fā)PAH致右心室重構(gòu)和右心功能減退(NullMCT VS NullSham；shNSD2MCTvs shNSD2Sham):右室舒張末期內(nèi)徑(RVEDD)、右心室舒張末期容積(RVEDV)、右室收縮末期內(nèi)徑(RVESD)、右心室收縮末期容積(RVESV)、右心室后壁厚度(RVPWT)、室間隔厚度(IVST)明顯升高；右室射血分?jǐn)?shù)(RVEF)、右室縮短分?jǐn)?shù)(RVFS)、RR間期校正肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間(PAAT/CL)顯著降低；下調(diào)NSD2表達(dá)顯著抑制右心室重構(gòu)、改善右心功能(shNSD2MCTvs Null MCT):RVEDD、RVEDV、RVESD、RVESV、RVPWT、IVST明顯升高,RVEF、RVFS、PAAT/CL顯著降低。(5)MCT誘導(dǎo)肺動(dòng)脈中膜增厚和右心室惡性重構(gòu)(NullMCTvs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham):肺動(dòng)脈相對(duì)厚度(PAMT%)、右心室質(zhì)量與體重比(RV/BW)、右心室與左心室+室間隔質(zhì)量比[RV/(LV+S)]明顯升高；下調(diào)NSD2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈中膜增厚和右心室惡性重構(gòu)(shNSD2MCT vs NullMCT):PAMT%、RV/BW和RV/(LV+S)顯著降低。(6)MCT誘導(dǎo)的PAH可見H3K36二甲基化(H3K36me2)水平升高(NullMCT vs Null Sham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下調(diào) NSD2 表達(dá)可下調(diào) H3K36me2(shNSD2MCT vs NullMCT)。(7)NSD2主要表達(dá)于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)中。(8)MCT誘導(dǎo)的PAH可見葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glutl)和丙酮酸脫氫酶(PDH)表達(dá)降低(NullMCT vs Null Sham;shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；乳酸脫氫酶(LDH)、肉毒堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)和含氧酸輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶 1(OXCT1)表達(dá)升高(NullMCT vs NullSham；shNSD2MCT vs shNSD2Sham)；下調(diào)NSD2表達(dá)可下調(diào)OXCT1表達(dá)(shNSD2MCT vs NullMCT)。結(jié)論:NSD2通過催化H3K36二甲基化,參與PAH發(fā)生發(fā)展,而下調(diào)NSD2表達(dá)可抑制PAH的發(fā)生發(fā)展。第3章NSD2調(diào)控PAH的代謝組學(xué)分析目的:篩選PAH組內(nèi)差異性代謝產(chǎn)物,探討差異性代謝產(chǎn)物的調(diào)控功能和在PAH中的可能作用。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對(duì)照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關(guān)病毒(AAV)建立NSD2干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對(duì)照)下調(diào)NSD2表達(dá),以重組病毒感染H9C2細(xì)胞后檢測(cè)NSD2 mRNA評(píng)價(jià)沉默效果,重組病毒(5×1012)經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠；實(shí)驗(yàn)分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即 AAV-shNSD2 和 MCT注射組；shNSD2Sham組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后收取肺組織,提取代謝產(chǎn)物和總蛋白；利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析不同組別大鼠肺組織差異性代謝產(chǎn)物,并篩選出與NSD2表達(dá)下調(diào)有關(guān)的代謝產(chǎn)物；利用KEGG代謝通路富集分析和網(wǎng)狀分析,探討該代謝產(chǎn)物在信號(hào)通路中的功能及其在PAH的可能作用。利用Western blot檢測(cè)白噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH可見肺組織內(nèi)11種代謝產(chǎn)物升高(NullMCT vs Null Sham)；下調(diào)NSD2表達(dá)后,該11中產(chǎn)物中唯有海藻糖下降(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Shsm vs Null Sham)。(2)海藻糖主要參與的通路包括:ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器、礦物吸收、蛋白消化與吸收、代謝通路、氨酰基-tRNA生物合成、突觸囊泡循環(huán)、氨基酸合成、氰基氨基酸代謝、植物次生代謝產(chǎn)物生物合成和乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。(3)海藻糖參與PAH可能是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器和代謝通路發(fā)揮作用。(4)下調(diào)NSD2表達(dá)后,促自噬因子LC3-Ⅱ,Beclin1和phos-AMPK表達(dá)顯著下降,自噬抑制因子P62顯著升高。結(jié)論:NSD2可能通過調(diào)控海藻糖的代謝,以ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器和代謝通路為介導(dǎo),參與PAH發(fā)生發(fā)展。海藻糖可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與PAH的發(fā)生發(fā)展。第4章NSD2調(diào)控PAH的表達(dá)譜分析目的:篩選介導(dǎo)NSD2調(diào)控代謝重編的下游靶基因,為后續(xù)研究NSD2在PAH中的調(diào)控機(jī)制研究做準(zhǔn)備。方法:以野百合堿(MCT)腹腔注射(60mg/kg,生理鹽水對(duì)照),建立大鼠PAH模型；利用腺相關(guān)病毒(AAV)建立NSD2干擾重組病毒(AAV-shNSD2,AAV-Null為對(duì)照)下調(diào)NSD2表達(dá),以重組病毒感染H9C2細(xì)胞后檢測(cè)NSD2 mRNA評(píng)價(jià)沉默效果,重組病毒(5×1012)經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠；實(shí)驗(yàn)分為四組:NullMCT組即AAV-Null和MCT注射組；NullSham組即AAV-Null和生理鹽水注射組；shNSD2MCT組即 AAV-shNSD2 和 MCT 注射組；shNSD2Sham 組即AAV-shNSD2和生理鹽水注射組；3周后收取肺組織,提取總RNA；利用Illumina Hiseq2000TM二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PAH組內(nèi)差異性表達(dá)的mRNA;利用基因本體論分別從細(xì)胞定位、分子功能和生物過程三個(gè)角度分析差異性表達(dá)基因的富集情況；利用KEGG通路富集分析,探討差異性表達(dá)基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的富集情況；利用聚類分析,以熱圖形式篩選可能參與調(diào)控PAH的NSD2下游靶基因。結(jié)果:MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH可見大量mRNA表達(dá)上調(diào)的基因(NullMCT vs Null Sham),其中下調(diào)NSD2表達(dá)可引起以下代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)下調(diào)(shNSD2MCT vs NullMCT,shNSD2Sham vs NullSham):TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和 TXNIP表達(dá)顯著降低。結(jié)論:TM4SF1、MID1IP1、PDE3A、MUC13、FOLR1、MTSS1L和TXNIP可能作為NSD2的下游基因,介導(dǎo)NSD2調(diào)控代謝重編,參與PAH發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

第 2 章 NSD2 在 PAH 中的作用及其調(diào)控機(jī)制照南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部和美國國立衛(wèi)生研究院的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，并已取得學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。 NSD2 干擾載體構(gòu)建1 腺相關(guān)病毒載體研究使用 pAAV-2xU6 載體，將目的片斷插入 XbaⅠ和 SpeⅠ區(qū)，由 U調(diào)控表達(dá)。（圖 2.2.2.1）

PCR.4。學(xué)分析用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ( X±SD) 表示，所獲數(shù)據(jù)采用 SP，以 P<0.05 表示有顯著性差異，，P<0.01 表示有非導(dǎo) NSD2 沉默效率鑒定感染 H9C2 細(xì)胞后，抽提總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNARNA 相對(duì)表達(dá)，以 GAPDH mRNA 為內(nèi)參，結(jié)果見hNSD2 可顯著下調(diào) NSD2 mRNA 的表達(dá)，提示 AA。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R544.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號(hào)：2646234