【摘要】：第一部分:中性粒細(xì)胞在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大及心力衰竭中的作用目的:探討中性粒細(xì)胞在非缺血性心肌損傷中的激活及作用。方法:采用小鼠橫向主動(dòng)脈弓縮窄(TAC)模型建立壓力超負(fù)荷,誘導(dǎo)心肌肥厚及心力衰竭,采用Ly6G抗體注射以清除中性粒細(xì)胞。(1)分為假手術(shù)組和TAC組,于TAC術(shù)后3天,使用流式細(xì)胞儀檢測骨髓中的Lin-Sca1+c Kit+(LSK)和粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)數(shù)量,心臟中募集的中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量,并測量心臟重量。(2)分為同型對照+假手術(shù)組,同型對照+TAC組,Ly6G抗體+TAC組。對小鼠進(jìn)行TAC手術(shù),并于TAC手術(shù)的對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(-2,1,4,7,10,13天)注射Ly6G抗體清除中性粒細(xì)胞。分別使用超聲儀檢測心功能參數(shù)(PWTd,LVDd,LVDs,FS),q PCR檢測ANP,BNP,β/αMHC基因的表達(dá)水平,免疫熒光染色檢測心肌細(xì)胞橫截面積,并測量心臟重量和脛骨長度。(3)分為同型對照+TAC組,Ly6G抗體+TAC組。對小鼠進(jìn)行TAC手術(shù),并于TAC手術(shù)的對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(-2,-1,1天)注射Ly6G抗體清除中性粒細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測心臟中募集的Ly6Chi單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。(4)分為同型對照+假手術(shù)組,同型對照+TAC組,Ly6G抗體+TAC組。對小鼠進(jìn)行TAC手術(shù),并于TAC手術(shù)的對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(-2,-1,1天)注射Ly6G抗體清除中性粒細(xì)胞。采用q PCR檢測Il1β,Il6,Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)TAC術(shù)后3天,與假手術(shù)組相比,TAC組小鼠骨髓中的LSK細(xì)胞(p0.01)和GMP細(xì)胞數(shù)量顯著增加(p0.01)。(2)TAC術(shù)后3天,與假手術(shù)組相比,TAC組小鼠心臟中募集的中性粒細(xì)胞(p0.01)和單核細(xì)胞數(shù)量(p0.001)顯著增加,巨噬細(xì)胞呈增加的趨勢(p=0.0519)。(3)TAC術(shù)后3天,假手術(shù)組與TAC組小鼠的心臟重量無明顯差異。(4)TAC術(shù)后14天,同型對照+TAC組小鼠的心臟重量/脛骨比(HW/TL)顯著高于同型對照+假手術(shù)組(p0.0001),Ly6G抗體+TAC組的HW/TL相比于同型對照+TAC組小鼠顯著降低(p0.001)。(5)TAC術(shù)后14天,同型對照+TAC組小鼠的心功能參數(shù)左室后壁厚度(PWTd),左室舒張期末內(nèi)徑(LVDd)和左室收縮期末內(nèi)徑(LVDs)均較基線水平顯著增加且高于同型對照+假手術(shù)組(p0.01),左室短軸縮短率(FS)較基線水平顯著降低且低于同型對照+假手術(shù)組(p0.0001)。Ly6G抗體+TAC組小鼠的PWTd和LVDs較同型對照+TAC組小鼠顯著降低(p0.05),FS則顯著升高(p0.05),與同型對照+假手術(shù)組無明顯差異。(6)TAC術(shù)后14天,與同型對照+假手術(shù)組相比,同型對照+TAC組小鼠心臟的心肌損傷因子ANP,BNP,β/αMHC表達(dá)水平顯著升高(p0.01)。心肌損傷因子在Ly6G抗體+TAC組小鼠中的表達(dá)水平則較同型對照+TAC組顯著降低(p0.05),與同型對照+假手術(shù)組無明顯差異。(7)TAC術(shù)后14天,與同型對照+假手術(shù)組相比,同型對照+TAC組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大(p0.0001)。Ly6G抗體+TAC組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積則較同型對照+TAC組顯著降低(p0.0001)。(8)TAC術(shù)后2天,與同型對照+TAC組相比,Ly6G抗體+TAC組小鼠心臟中募集的Ly6Chi單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著減少(p0.01)。(9)TAC術(shù)后2天,與同型對照+假手術(shù)組相比,同型對照+TAC組心臟中炎癥因子Il1β,Il6,和趨化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表達(dá)水平均顯著升高(p0.01),Ly6G抗體+TAC組小鼠心臟中該基因的表達(dá)水平則較同型對照+TAC組顯著降低,其中Il1β和Ccl2基因的表達(dá)呈降低趨勢,與同型對照+假手術(shù)組無明顯差異。結(jié)論:中性粒細(xì)胞在心臟壓力超負(fù)荷下被激活并募集至心臟中。清除中性粒細(xì)胞可緩解由壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及心功能不全。第二部分:髓系來源的Wnt5a對中性粒細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制目的:探討髓系來源的Wnt5a對中性粒細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制。方法:(1)建立小鼠TAC和心肌梗死(MI)模型,采用流式分選,分別從小鼠外周血分選出中性粒細(xì)胞,Ly6Chi單核細(xì)胞和Ly6Clo單核細(xì)胞,從TAC術(shù)后3天的小鼠心臟和MI術(shù)后3天的小鼠心臟中分別分選出成纖維細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,并采用q PCR檢測其Wnt5a基因表達(dá)水平。(2)從小鼠外周血中,采用流式分選儀分選出中性粒細(xì)胞,Ly6Chi單核細(xì)胞和Ly6Clo單核細(xì)胞,并采用q PCR檢測其Frizzled(Fzd1-10)受體的基因表達(dá)水平。(3)從小鼠骨髓中提取中性粒細(xì)胞,給予不同濃度的Wnt5a刺激(0,100,500μg/ml),采用改良Boyden小室法檢測中性粒細(xì)胞的遷移情況。(4)從小鼠骨髓中提取中性粒細(xì)胞,給予不同時(shí)間點(diǎn)(0,10,30,60min)的Wnt5a刺激(400ng/ml),采用western blotting檢測PI3K,JNK1/2,Erk的蛋白磷酸化表達(dá)水平。結(jié)果:(1)Wnt5a的基因表達(dá)水平很容易地在心肌成纖維細(xì)胞,TAC術(shù)后3天的心臟中性粒細(xì)胞,和MI術(shù)后3天的心臟中性粒細(xì)胞中檢測到;在TAC/MI術(shù)后的心臟巨噬細(xì)胞中僅檢測到顯著更低的Wnt5a基因表達(dá);未在TAC/MI術(shù)后的心臟Ly6Chi單核細(xì)胞中檢測到Wnt5a的表達(dá);未在血液中的中性粒細(xì)胞,Ly6Chi單核細(xì)胞,Ly6Clo單核細(xì)胞檢測到Wnt5a的基因表達(dá)。(2)僅在外周血中性粒細(xì)胞中檢測到Fzd5受體基因的的高表達(dá),顯著高于其在Ly6Chi單核細(xì)胞和Ly6Clo單核細(xì)胞中的表達(dá)水平。(3)與未處理組相比,外源性添加Wnt5a顯著刺激了中性粒細(xì)胞的遷移,且呈劑量依賴性(p0.05)。(4)與未處理組相比,外源性添加Wnt5a顯著增加了PI3K,JNK和ERK的磷酸化蛋白表達(dá)水平,且在刺激30min時(shí)為表達(dá)峰值。結(jié)論:Wnt5a的髓系細(xì)胞來源是活化的中性粒細(xì)胞。Wnt5a可能作為中性粒細(xì)胞的自分泌調(diào)節(jié)劑,通過激活PI3K/JNK/ERK信號通路調(diào)控中性粒細(xì)胞的遷移等功能。第三部分:髓系特異性Wnt5a敲除對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)下心臟肥大及心力衰竭的影響目的:探討髓系特異性Wnt5a敲除在壓力超負(fù)荷模型誘導(dǎo)下心臟肥大及心力衰竭中的作用。方法:(1)構(gòu)建Wnt5a髓系細(xì)胞特異性敲除(Myelo-KO)小鼠。提取Myelo-KO小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞及TAC術(shù)后3天心臟中的中性粒細(xì)胞,并純化基因組DNA,采用PCR檢測Wnt5a的基因重組。(2)分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-KO+TAC組。于TAC術(shù)后0,3,7,28天分離心臟并采用流式細(xì)胞儀檢測心臟中中性粒細(xì)胞,Ly6Chi單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞的數(shù)量。(3)小鼠分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-KO+TAC組,于TAC術(shù)后3天,采用q PCR檢測心臟中炎癥因子Il1β,Il6,和趨化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表達(dá)水平。(4)小鼠分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-KO+TAC組。于TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,8周)檢測心臟重量/脛骨長度比(HW/TL),肺重量/脛骨長度比(LW/TL)。(5)小鼠分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-KO+TAC組。于TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0,1,4,8周)采用超聲儀檢測心功能參數(shù)LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(6)在對照和Wnt5a Myelo-KO小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-8周處理,采用免疫熒光染色檢測心肌細(xì)胞橫截面積。(7)在對照和Wnt5a Myelo-KO小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-8周處理,采用免疫組織化學(xué)染色檢測心臟間質(zhì)纖維化面積。結(jié)果:(1)證實(shí)了Myelo-KO小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞中發(fā)生了Wnt5位點(diǎn)的基因重組,Wnt5a的外顯子2被去除。Myelo-KO小鼠TAC術(shù)后募集至心臟中的中性粒細(xì)胞逃脫了重組酶介導(dǎo)的基因重組。(2)與對照組相比,Myelo-KO小鼠在TAC術(shù)后3天和7天后中性粒細(xì)胞,Ly6Chi單核細(xì)胞募集至心臟中的數(shù)量均顯著降低(p0.0001),巨噬細(xì)胞募集至心臟中的數(shù)量在TAC術(shù)后7天顯著降低(p0.001)。(3)TAC術(shù)后3天,與對照組相比,Myelo-KO小鼠心臟中的炎癥因子及趨化因子的基因表達(dá)水平均顯著降低(p0.001)。(4)與對照組相比,Myelo-KO小鼠的HW/TL在TAC術(shù)后2周和8周顯著降低(p0.0001);LW/TL在TAC術(shù)后8周顯著降低(p0.0001)。(5)Myelo-KO小鼠在TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(1,4,8周)的LVPWTd,LVDd,LVDs較對照組顯著降低(p0.01);FS較對照組顯著升高(p0.0001)。(6)Myelo-KO小鼠在TAC術(shù)后8周的心肌細(xì)胞橫截面積較對照組顯著減少(p0.001)。(7)Myelo-KO小鼠在TAC術(shù)后8周的心臟間質(zhì)纖維化面積較對照組顯著減少(p0.001)。結(jié)論:髓系特異性Wnt5a敲除顯著降低了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng),顯著緩解了心臟肥大及心力衰竭。第四部分:髓系特異性Wnt5a過表達(dá)對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)下心臟肥大及心力衰竭的影響目的:探討髓系特異性過表達(dá)Wnt5a對壓力超負(fù)荷模型誘導(dǎo)下心臟肥大及心力衰竭的影響。方法:(1)構(gòu)建Wnt5a髓系細(xì)胞特異性過表達(dá)(Myelo-TG)小鼠。提取對照及Myelo-TG小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞,分別采用q PCR檢測Wnt5a基因表達(dá)水平,western blotting檢測Wnt5a蛋白表達(dá)水平。(2)在對照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-2周處理,采用免疫組織化學(xué)染色檢測心臟中的Mac2細(xì)胞表達(dá)數(shù)量。(3)在對照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-7天處理,采用流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞募集至心臟中的數(shù)量。(4)在對照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中進(jìn)行TAC,于術(shù)后3天,采用q PCR檢測心臟中炎癥因子Il1β,Il6,和趨化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表達(dá)水平。(5)小鼠分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-TG+TAC組。于TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,8周)檢測HW/TL,LW/TL。(6)小鼠分為對照+TAC組,Wnt5a Myelo-TG+TAC組。于TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0,1,4,8周)采用超聲儀檢測心功能參數(shù)LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(7)在對照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-8周處理,采用免疫熒光染色檢測心肌細(xì)胞橫截面積。(8)在對照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中進(jìn)行假手術(shù)和TAC-8周處理,采用免疫組織化學(xué)染色檢測心臟間質(zhì)纖維化面積。結(jié)果:(1)證實(shí)了Myelo-TG小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞中Wnt5a的基因和蛋白水平的過表達(dá)。(2)與對照組相比,Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后2周募集至心臟中的Mac2+陽性數(shù)量顯著升高(p0.0001)。(3)與對照組相比,Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后7天募集至心臟中的中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(p0.05)。(4)與對照組相比,Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后3天心臟中炎癥因子Il1β,Il6和趨化因子Cxcl2,Ccl2基因的表達(dá)水平均顯著升高(p0.05)。趨化因子Cxcl1,Cxcl5呈增高趨勢。(5)與對照組相比,Myelo-TG小鼠的HW/TL在TAC術(shù)后2周和8周顯著增加(p0.01);LW/TL在TAC術(shù)后8周顯著增加(p0.001)。(6)Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(1,4,8周)的LVPWTd,LVDd,LVDs較對照組顯著升高(p0.001);FS較對照組顯著降低(p0.0001)。(7)Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后8周的心肌細(xì)胞橫截面積較對照組顯著增加(p0.001)。(7)Myelo-TG小鼠在TAC術(shù)后8周的心臟間質(zhì)纖維化面積較對照組顯著增加(p0.001)。結(jié)論:髓系特異性Wnt5a過表達(dá)顯著增加了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng),顯著促進(jìn)了心臟肥大及心力衰竭。第五部分:中性粒細(xì)胞清除對髓系特異性Wnt5a過表達(dá)在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)中心臟效應(yīng)的影響目的:探討中性粒細(xì)胞清除對髓系特異性過表達(dá)Wnt5a在壓力超負(fù)荷模型中心臟效應(yīng)的影響。方法:(1)在對照和Myelo-TG小鼠中建立TAC模型2周,并在TAC手術(shù)的不同時(shí)間點(diǎn)(-2,1,4,7,10,13天)分別對各基因型小鼠進(jìn)行同型對照或Ly6G抗體注射清除中性粒細(xì)胞。(1)測量各組小鼠的HW/TL。(2)采用超聲儀檢測各組小鼠在TAC2周后的心功能參數(shù)LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(3)采用q PCR檢測各組小鼠在TAC2周后心臟中心肌損傷因子ANP,β/αMHC基因的表達(dá)水平。(4)采用免疫熒光染色檢測各組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積。結(jié)果:(1)在WT小鼠和Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗體的小鼠在TAC術(shù)后2周的HW/TL較注射同型對照組小鼠相比均顯著降低(p0.05),且在Myelo-TG小鼠中的降低程度顯著更高。(2)在Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗體使LVPWTd,LVDd,LVDs的升高降至正常水平(p0.001),FS的降低升至正常水平(p0.0001),與對照組小鼠無明顯差異。(3)在Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗體使升高的心肌損傷因子ANP,β/αMHC基因的表達(dá)水平顯著降低(p0.01)。(4)在WT小鼠和Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗體的小鼠在TAC術(shù)后2周的心肌細(xì)胞橫截面積均顯著降低(p0.0001),去除了對照組與Myelo-TG組的組間差異。結(jié)論:中性粒細(xì)胞清除逆轉(zhuǎn)了髓系特異性Wnt5a過表達(dá)導(dǎo)致的顯著加劇的壓力超負(fù)荷下的心臟肥大及心力衰竭。
【圖文】：

40圖 1.1 心臟壓力超負(fù)荷對骨髓細(xì)胞的影響fects of myocardial pressure overload on bon**p <0.01大量免疫細(xì)胞募集至心臟中分析中可見髓系祖細(xì)胞在 TAC 術(shù)后 3 性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放入血，且募計(jì)心臟流式實(shí)驗(yàn)檢測 TAC 手術(shù)對心臟：與假手術(shù)組相比，TAC 手術(shù)后 3 天的

總的白細(xì)胞：CD45+中性粒細(xì)胞：CD45+, CD11b+, Ly6G+Ly6Chi單核細(xì)胞: CD45+, CD11b+, Ly6G-, Ly6Chi巨噬細(xì)胞: CD45+, CD11b+, Ly6G-, F4/80+
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6

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本文編號：2645339