【摘要】：研究背景動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管系統(tǒng)中最常見的疾病之一,其發(fā)病機制一直是研究的熱點,陸續(xù)出現(xiàn)許多相關(guān)學(xué)說。近年來,臨床研究提示動脈粥樣硬化的多發(fā)區(qū)域存在共同的血流動力學(xué)特點,即血流剪切力改變。正常的生理層流剪切力對血管內(nèi)皮細胞具有保護作用,促進擴血管活性物質(zhì)的分泌,抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展;異常的病理剪切力增強血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并促進縮血管活性物質(zhì)和炎性介質(zhì)的分泌,促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展。20世紀90年代,一種新的凋亡相關(guān)基因,即程序性細胞死亡因子4(Programmed Cell Death 4,PDCD4)由Shibahara等發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)PDCD4具有調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用,并參與多種免疫性、代謝性和炎癥性疾病的過程。既往研究發(fā)現(xiàn)PDCD4與心血管疾病關(guān)系密切,促進血管平滑肌細胞凋亡,抑制血管外膜成纖維細胞增殖,增加動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定性,加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,但具體機制尚不清楚。自噬是一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象,廣泛存在于真核細胞中,也是一種新的程序性細胞死亡形式,通過降解細胞內(nèi)的代謝廢物并更新細胞器,來維持內(nèi)環(huán)境平衡。研究發(fā)現(xiàn)自噬與心血管系統(tǒng)關(guān)系密切,自噬流的減弱與細胞衰老所致的心肌肥大、心功能降低有關(guān)。心肌細胞缺血誘導(dǎo)自噬增強,而增強細胞自噬則能夠有效減輕再灌注所致?lián)p傷。細胞自噬和血流剪切應(yīng)力,兩者之間存在相互作用,直接或間接影響動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展。但是,病理性震蕩剪切力如何調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞自噬,PDCD4是否參與這個過程尚不清楚。炎癥反應(yīng)參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展多個過程。研究發(fā)現(xiàn)活化的NLRP3炎性小體能夠顯著增加巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化。病理性震蕩剪切力是否影響血管內(nèi)皮細胞炎性小體的表達,PDCD4是否參與該過程?這些問題尚需明了。目的1.觀察病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞自噬和炎癥小體的影響。2.觀察PDCD4是否介導(dǎo)病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞自噬和炎癥小體的作用。方法1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)體外提取和培養(yǎng)確保無菌條件,獲取狀態(tài)良好的長約15-30cm的新生兒臍帶,使用己預(yù)熱無菌生理鹽水沖洗管腔,后注入己預(yù)熱的胰酶消化液在室溫下消化,吸出胰酶消化液并使用1X PBS溶液,反復(fù)沖洗。離心后,棄上清液,加入培養(yǎng)液,混勻細胞,將懸浮液移至無菌培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中,24小時后更換培養(yǎng)液,每隔一天更換培養(yǎng)液。2.體外剪切力干預(yù)將I型鼠尾膠原均鋪在高壓滅菌的載玻片上,晾干后,體外培養(yǎng)良好的4-7代HUVECs均勻接種于玻片上,待細胞密度達90%,給予0、1、3、6、9、12、24小時的病理震蕩剪切力(0±4 dyne/cm2大小,頻率為1Hz)刺激。觀察病理性震蕩剪切力對HUVECs中PDCD4表達的影響,并找到適宜的刺激時間,用于后續(xù)的實驗研究。3.細胞轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染的PDCD4 siRNA及陰性對照siRNA均購自上海吉瑪基因生物科技有限公司,具體步驟按照Lipo2000試劑說明書,轉(zhuǎn)染6-8小時后換液,并進行相應(yīng)的實驗刺激和檢測。4.蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)利用蛋白提取工作液提取蛋白,行SDS-PAG電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫牛奶封閉、4℃一抗孵育、對應(yīng)二抗孵育、化學(xué)顯影,獲得蛋白條帶灰度值,統(tǒng)計學(xué)分析。5.實時熒光定量PCR(RT-PCR)TRIzol法提取HUVECs中總RNA。使用日本TaKaRa試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),根據(jù)說明書制備反應(yīng)體系。使用日本TaKaRa的SYBR試劑盒,根據(jù)說明書制備反應(yīng)體系,行實時熒光定量PCR檢測。6.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析,平均值±標準誤。非配對t檢驗用于兩組間比較,多樣本分析采用ANOVA單因素的方差分析方法,P0.05認為存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.病理性震蕩剪切力上調(diào)HUVECs中PDCD4的表達與靜止對照組相比,病理性震蕩剪切力干預(yù)下,隨著時間的延長PDCD4的蛋白表達水平上調(diào),力學(xué)干預(yù)6小時至24小時有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);病理性震蕩剪切力干預(yù)6和9小時PDCD4 mRNA表達上調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),并在6小時到達峰值。提示病理性震蕩剪切力可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HUVECs中PDCD4 mRNA,并促進HUVECs中PDCD4蛋白的表達。2.PDCD4參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的自噬在靜止條件下,與陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染siRNA后沉默PDCD4,LC3BII/I、ATG5、free ATG12、conj ATG12、P62表達下調(diào)(P0.05),ATG3、ATG7、Beclin表達無明顯變化。提示PDCD4參與血管內(nèi)皮細胞自噬的部分過程的調(diào)節(jié)。3.病理性震蕩剪切力參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的自噬與靜止對照組相比,力學(xué)作用3、6、9小時LC3BII/I表達上調(diào)有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖3.A),且6小時到達峰值。給予病理性震蕩剪切力刺激體外培養(yǎng)HUVECs 6小時,通過Western Blot檢測HUVECs中自噬相關(guān)分子蛋白表達。實驗結(jié)果顯示:在陰性對照組中,與靜止對照相比,病理性震蕩剪切力促進ATG5、free ATG12、conj ATG12、ATG3、ATG7、P62蛋白的表達(P0.05),對Beclin表達無明顯影響。提示病理性震蕩剪切力參與血管內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)節(jié)。4.PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)節(jié)與陰性對照組相比,沉默PDCD4,能夠阻斷病理性震蕩剪切力對LC3BII/I、ATG5、free ATG12、conj ATG12、P62的促進(P0.05),但對ATG3、ATG7、Beclin的表達無明顯影響(P0.05)。提示PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞自噬調(diào)節(jié)的部分過程。5.PDCD4參與血管內(nèi)皮細胞炎性小體的調(diào)節(jié)在靜止條件下,與陰性對照組相比,沉默PDCD4,NLRP3、ASC的mRNA和蛋白均表達下調(diào)(P0.05)。提示PDCD4參與血管內(nèi)皮細胞炎性小體的調(diào)節(jié)。6.病理性震蕩剪切力參與血管內(nèi)皮細胞炎性小體的調(diào)節(jié)在陰性對照組細胞中,和靜止對照組相比,病理性震蕩剪切力促進NLRP3、ASC mRNA和蛋白的表達(P0.05)。提示病理性震蕩剪切力促進血管內(nèi)皮細胞炎性小體表達。7.PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞炎性小體的調(diào)節(jié)與陰性對照組相比,沉默PDCD4,能夠阻斷病理性震蕩剪切力對NLRP3、ASC mRNA和蛋白的促進(P0.05)。提示PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞炎性小體的調(diào)節(jié)。結(jié)論1.病理性震蕩剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞自噬和炎性小體。2.PDCD4介導(dǎo)病理性震蕩剪切力對血管內(nèi)皮細胞自噬和炎性小體的作用。
【圖文】：

；邐邋邐邐邐逡逑圖１．實驗技術(shù)流程圖逡逑陰性對照組：ＨＵＶＥＣｓ邋中轉(zhuǎn)染邋ｓｉＲＮＡ邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ；逡逑ＰＤＣＤ４邋ｓｉＲＮＡ邋轉(zhuǎn)染組：ＨＵＶＥＣｓ邋中轉(zhuǎn)染邋ＰＤＣＤ４邋ｓｉＲＮＡ；逡逑

－１ｈ邋３ｈ邋６ｈ邋９ｈＯＳＳ邐－邐－邐＋邐＋逡逑圖３．病理性震蕩剪切力干預(yù)下ＰＤＣＤ４對ＨＵＶＥＣｓ中自噬相關(guān)分子的影響逡逑Ａ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測病理性震蕩剪切力作用Ｏｈ、ｌｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ、１２ｈ后，，逡逑＊
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2644824