【摘要】：[背景]心房顫動(AtrialFibrillation,AF)是臨床上最常見的心律失常,已逐漸成為一種心血管流行病,具有較高的發(fā)病率及病死、病殘率,其疾病本身及其并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅人們健康。多項研究提示,自主神經(jīng)張力失衡引發(fā)心臟電-解剖重構(gòu),在AF的發(fā)生和維持中扮演重要角色,參與了房顫的發(fā)生與維持。脊髓電刺激(Spinal Cord Stimulation,SCS)治療可通過向特定脊髓節(jié)段發(fā)放低能量、高頻率的電刺激,調(diào)控機(jī)體自主神經(jīng)活性與自主神經(jīng)張力的平衡,提示干預(yù)自主神經(jīng)系統(tǒng)的活性與張力可治療心房顫動,已有以內(nèi)在自主神經(jīng)(ICN)為靶點的治療心房顫動的方法,但具有一定的局限性。通過干預(yù)外在自主神經(jīng)(ECN)的方式,向外在自主神經(jīng)所在的特定脊髓節(jié)段釋放能量進(jìn)行電刺激來治療心房顫動具有巨大的潛力與前景。[目的]通過對比格犬心房顫動模型實施脊髓電刺激治療,觀察脊髓電刺激治療對治療心房顫動的可行性及治療效果,深入探討其方法學(xué)及可能的顯效機(jī)制,為探索心房顫動的治療新策略,開拓新的治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。[方法]1.選取18只成年比格犬,雌雄不拘,隨機(jī)分為空白對照組(Ctrl組,6只),不接受脊髓電刺激的心房顫動模型組(AF組,6只),接受脊髓電刺激的心房顫動模型組(SCS組,6只)。進(jìn)行犬心房顫動模型的建立及脊髓電刺激治療心房顫動犬的研究。(1)運用Medtronic公司研發(fā)的SelectSecure系統(tǒng),植入目前最細(xì)的雙極實心電極導(dǎo)線-3830主動固定電極,連接專用房顫模型起搏器建立心房起搏系統(tǒng)。術(shù)后采用AOO起搏模式下的快速心房起搏的方法建立心房顫動模型。術(shù)前及術(shù)后每周描記標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖,同時運用植入式心電監(jiān)測器Reveal LINQ追蹤器實時追蹤房顫的發(fā)生。(2)在SCS組,借助成熟的腰穿技術(shù),經(jīng)實驗犬L2-L3腰椎間隙以小于45度進(jìn)行穿刺,植入標(biāo)準(zhǔn)間距8觸點經(jīng)皮穿刺電極導(dǎo)線,連接脊髓刺激器,建立脊髓電刺激系統(tǒng)。在脊髓電刺激期間,運用植入式心電監(jiān)測器Reveal LINQ追蹤器實時監(jiān)測治療期間的房顫負(fù)荷。(3)AF組實驗犬在術(shù)前、房顫模型成功建立后、處死前進(jìn)行超聲心動圖檢查;SCS組實驗犬在術(shù)前、房顫模型成功建立后、脊髓電刺激達(dá)到治療療程后、處死前進(jìn)行超聲心動圖的檢查;Ctrl組實驗犬均進(jìn)行同期超聲心動圖檢查,經(jīng)心尖四腔測量左、右心房收縮末期心房面積。(4)運用CARTO系統(tǒng)對心臟進(jìn)行三維建模標(biāo)測,將心內(nèi)電生理信息與心腔內(nèi)空間解剖結(jié)構(gòu)結(jié)合起來。在對雙心房建模標(biāo)測的過程中,創(chuàng)新性地在無X射線的情況下,成功穿刺股靜脈,經(jīng)鞘管置入PentaRay高精密度標(biāo)測導(dǎo)管,構(gòu)建右心房和上下腔靜脈三維模型;于胸部左側(cè)第四至第五肋間,作一長約3厘米橫行切口,在胸廓撐開器輔助下暴露心臟,縱向剪開心包,暴露左心耳。直視下穿刺心耳尖,經(jīng)鞘管植入PentaRay高精密度標(biāo)測導(dǎo)管,快速建立左心房體部,肺靜脈前庭部和左心耳三維模型,并進(jìn)行電生理指標(biāo)的測定。(5)處死實驗犬。處死前采集血液標(biāo)本,離心后儲存?zhèn)錂z。處死實驗犬后,取出心臟后,分離采集左心房組織。分別進(jìn)行光鏡、電鏡、免疫組化及左心房組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)研究。2.采用Label free蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)分析AF組、SCS組及Ctrl組實驗犬血清標(biāo)本中差異蛋白的表達(dá)量。通過生物信息學(xué)的分析,使用聚類分析對表達(dá)有差異的蛋白進(jìn)行聚類分析、GO分析、蛋白互作分析等。對三組間進(jìn)行差異蛋白的選擇,并運用ELISA進(jìn)行驗證部分研究相關(guān)的差異蛋白的表達(dá)量,初篩在SCS干預(yù)AF過程中,具有指導(dǎo)意義、可發(fā)揮關(guān)鍵作用的的生物標(biāo)記蛋白。3.對AF組、SCS組及Ctrl組實驗犬左心房肌組織采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法,通過對整體基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,對三組間具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行篩選,挑選出差異基因,應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析、KEGG通路注釋及富集分析,找出差異基因顯著富集的GO和KEGG條目。運用qRT-PCR對部分差異基因進(jìn)行定量分析,并采用Western blot方法對部分差異表達(dá)基因的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗證。[結(jié)果]1.(1)18只實驗犬中,共有15只實驗犬完成實驗,其余3只在建模過程中死亡。在建立房顫模型過程中,建立房顫模型總成功率為100%。成功建立房顫模型的時間為10.63±2.13(周);房顫模型建立成功時,在AOO模式下,高頻房顫模型起搏器心房刺激頻率為588.75±11.26(次/分)。運用植入心電監(jiān)測器Reveal LINQ動態(tài)追蹤記錄AF組與SCS組房顫負(fù)荷。用以監(jiān)測心房顫動的發(fā)生與SCS治療后房顫的負(fù)荷變化,SCS組實驗犬的房顫負(fù)荷明顯低于AF組實驗犬(7.34±2.34%vs.46.43±5.16%,P0.001)。(2)采用美國GE Vividq心臟彩色超聲顯像儀,探頭發(fā)射頻率2.5MHZ對實驗犬進(jìn)行超聲心動圖的檢查。房顫模型制作成功后,左心房面積較建模前顯著增大(8.20±0.83cm2vs.3.80±0.08cm2,p0.05);右房面積較建模前增大(4.52±0.44cm2vs.2.75±0.96cm2,p0.05)。三組間進(jìn)行左心房面積與右心房面積的比較,SCS組左房面積較AF組減小(5.04±0.89cm2 vs.8.20±0.83cm2,P0.05),右房面積較 AF 組減小(4.20±0.13 cm2 vs.4.52±0.44cm2,p0.05);AF組左房面積較 Ctrl 組增大(8.20±0.83cm2vs.3.72±0.15cm2,p0.05);右房面積較 Ctrl 組增大(4.52±0.44cm2 vs.2.78±0.18cm2,p0.05);SCS 組左房面積較Ctrl 組增大(5.04±0.89cm2vs.3.72±0.15cm2,p0.05),右房面積較 Ctrl 組增大(4.20±0.13cm2 vs.2.78±0.18cm2,p0.05)(3)進(jìn)行電生理檢測,對三個組的實驗犬均進(jìn)行電生理檢查,測試左、右心房有效不應(yīng)期,AF組與Ctrl組相比,AF組左心房有效不應(yīng)期縮短(101.33±5.79ms vs.117.67±6.84ms,P0.05),右心房有效不應(yīng)期縮短(95.78±11.05ms vs.117.78±10.20ms,P0.05);SCS組與AF組相比,SCS組左心房有效不應(yīng)期延長,(106.33±5.61msvs.101.33±5.79,P0.05),差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;右心房有效不應(yīng)期延長,(101.44±9.26msvs.95.78±11.05ms,P0.05),差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;SCS組與Ctrl組相比,SCS組左心房有效不應(yīng)期縮短(106.33±5.61ms vs.117.67±6.84ms,0.05),右心房有效不應(yīng)期縮短(101.44±9.26ms vs.117.78±10.20ms,P0.05)。(4)對左心房心肌進(jìn)行光鏡觀察,結(jié)果提示在HE染色切片上,Ctrl組中左心房心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,細(xì)胞核清晰,規(guī)則的纖維網(wǎng)填充與整個心肌細(xì)胞;間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀規(guī)則數(shù)量適中。AF組中,心肌細(xì)胞增大,排列紊亂,細(xì)胞核大小不規(guī)則,核出現(xiàn)異型改變,部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯壞死,空泡變性及顆粒樣變性,細(xì)胞間質(zhì)疏松,出現(xiàn)心肌纖維化,有炎癥細(xì)胞的浸潤。SCS組中,心肌細(xì)胞完整,排列稍不整,胞核有部分異型改變,細(xì)胞溶解壞死較AF組減少,細(xì)胞間質(zhì)疏松,有部分心肌纖維化改變,但較AF組稍減少。對左心房心肌進(jìn)行電鏡觀察,結(jié)果提示Ctrl組左心房肌細(xì)胞的肌原纖維節(jié)的排列是有序的,核膜內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為正常;AF組左心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯異常,肌原纖維節(jié)出現(xiàn)了嚴(yán)重的退化,細(xì)胞核出現(xiàn)嚴(yán)重的固縮的現(xiàn)象,同時還可見有細(xì)胞的凋亡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫大征象,伴隨著部分肌絲的崩解,肌纖維表現(xiàn)出雜亂無序。SCS組心肌細(xì)胞有超微結(jié)構(gòu)的異常征象,但無AF組表現(xiàn)顯著,肌原纖維節(jié)可見一定程度的退化,但仍能看到大部分肌原纖維節(jié)排列整齊,部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,糖原增多,仍可見部分排列緊致的肌纖維。2.采用Label free蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)方法在三組實驗犬中,共可定量蛋白數(shù)349個。其中AF組與Control組差異蛋白數(shù)為18個,SCS組與Control組差異蛋白數(shù)為16個,SCS組與AF組差異蛋白數(shù)為23個。通過生物信息學(xué)的分析,對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析、GO分析、蛋白互作分析等。通過對部分差異蛋白KNG1、CFP、C1R、SERPINA4并運用ELISA進(jìn)行驗證,提示這四個差異蛋白在組間具有差異性,結(jié)果顯示:(1)在SCS組中,KNG1的表達(dá)量高于Ctrl組與AF組,在AF組中KNG1的表達(dá)量高于Ctrl組,組間有差異;(2)CFP的表達(dá)量在AF組顯著高于Ctrl和SCS組,Ctrl和SCS組表達(dá)無顯著差異;(3)SCS組中,C1R的表達(dá)量顯著低于AF組,同時也顯著低于Ctrl組,而AF組與Ctrl組間在C1R的表達(dá)量無顯著差異;(4)SERPINA4表達(dá)情況是SCS組的表達(dá)量顯著高于Ctrl和AF組。蛋白的表達(dá)變化趨勢與Lable free結(jié)果一致。3.對AF組、SCS組及Ctrl組實驗犬心房肌組織采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法,通過對整體基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,對組間具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行篩選,挑選出部分差異基因,其中表達(dá)上調(diào)的基因有MGST、MTMR2、EPHX2、INPP5、AMACR、ACOX2、IP6K3、ITPKC 和 PTGS2,表達(dá)下調(diào)的基因有 COL21A1、COL6A6、CRY2、SPP1、TFRC、SLC8A3、PER1、KCNJ8、MYLK3;通過聚類分析,對差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類,并對差異基因的進(jìn)行GO功能分析,對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway的功能注釋和歸類,根據(jù)KEGG顯效的通路機(jī)制中可能與Peroxisome,Primary bile acid biosythesis信號通路相關(guān)。運用實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(qRT-PCR)對選出的差異基因進(jìn)行定量分析,提示差異基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果大致一致,并采用Western blot方法驗證其中部分差異表達(dá)基因的蛋白表達(dá)水平。INPP5B在AF組的表達(dá)量顯著高于Ctrl組與SCS組,SCS組表達(dá)量較AF組顯著下調(diào),KCNJ8在AF組表達(dá)量顯著高于Ctrl組與SCS組,SCS組表達(dá)量較AF組顯著下調(diào),MGST表達(dá)量在AF組高于Ctrl組與SCS組,SCS組表達(dá)量較AF組、Ctrl組顯著下調(diào),IP6K3在AF組顯著低于Ctrl組及SCS組,SCS組表達(dá)量顯著高于Ctrl組與AF組。[結(jié)論]1.運用快速心房起搏可成功建立穩(wěn)定的心房顫動模型。運用SelectSecure系統(tǒng),植入3830雙極實心心房起搏電極,這一方法可精準(zhǔn)植入電極并提高在實驗犬中電極植入成功率。運用植入式心電監(jiān)測器(Reveal LINQ)實時動態(tài)監(jiān)測房顫負(fù)荷,可提高實驗監(jiān)測效率。2.通過運用SCS干預(yù)心房顫動實驗犬,是安全、可行、有效的,可減緩左心房的重構(gòu),對心房顫動導(dǎo)致的心房重構(gòu)具有改善作用。3.通過運用Label free定量蛋白質(zhì)組學(xué)初篩在SCS干預(yù)AF過程中差異表達(dá)蛋白,KNG1、CFP、C1R、SERPINA4等差異表達(dá)的蛋白與該干預(yù)過程可能具有相關(guān)性。本研究初篩具有指導(dǎo)意義、可發(fā)揮關(guān)鍵作用的差異蛋白,有望后續(xù)通過深入研究更精準(zhǔn)地獲得敏感性高、特異性好的生物標(biāo)記蛋白,為更長遠(yuǎn)的臨床工作提供動態(tài)監(jiān)測預(yù)后,開拓新靶點的研究依據(jù)。4.通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出在SCS干預(yù)AF實驗犬過程中,存在多個差異表達(dá)基因,可能與SCS治療AF的治療療效具有相關(guān)性,為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ),具有指導(dǎo)意義,可提供更多新的切入點。5.Peroxisome信號通路及Primary bile acid biosynthesis信號通路可能在SCS治療AF實驗犬的顯效機(jī)制中具有重要的調(diào)控作用,可為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供新的思路。
【圖文】：

圖２邐部分實驗所用材料逡逑．．

參數(shù)滿意后撤出鞘管并固定電極導(dǎo)線；將電極與起搏器連接，將埋藏式高頻逡逑率（頻率９０？８１０次／ｍｉｎ）房顫模型起搏器（中國秦明）埋藏于頸前外側(cè)的囊袋內(nèi)逡逑（圖２）。確認(rèn)生命體征正常后，術(shù)后注射青霉素８０萬Ｕ三天，預(yù)防感染。逡逑２４逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R541.75

【參考文獻(xiàn)】

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1 程祝強(qiáng);徐霜霜;金毅;;脊髓電刺激治療缺血性肢痛[J];國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志;2015年07期

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3 周超;龐璽倬;郭濤;;脊髓刺激治療頑固性心絞痛新進(jìn)展[J];中國循環(huán)雜志;2014年10期

4 袁斗;姚建民;譚琛;;心房顫動模型的建立[J];中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志;2014年05期

5 ;中國房顫抗凝的現(xiàn)狀與未來[J];中國心血管病研究;2014年09期

6 丁紹祥;;心房顫動時心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)的作用及意義[J];中國循環(huán)雜志;2014年02期

7 舒?zhèn)?陶蔚;胡永生;朱宏偉;李勇杰;;脊髓電刺激治療復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征[J];中國微侵襲神經(jīng)外科雜志;2013年02期

8 黃從新;;用心電生物學(xué)的理念研究心電活動與心律失常[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2010年05期

9 熊祖員;;補(bǔ)體C3與心房纖顫關(guān)系的臨床研究[J];中國實用醫(yī)藥;2010年21期

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本文編號：2642885