【摘要】：研究背景及目標:在心肌缺血過程中,多種因素介導的心肌細胞凋亡是心肌梗死和梗死后心室重構的基本病理特征。課題組既往研究已經發(fā)現miR-124參與平滑肌表型轉化及血管損傷后新生內膜形成。然而,對miR-124在心肌細胞凋亡中的作用依舊知之甚少。本研究試圖闡述miR-124對心肌細胞凋亡的作用,并鑒定miR-124靶基因,闡述其作用機制。研究方法:我們采用體外分離培養(yǎng)心肌細胞,利用H2O2和缺氧刺激,模擬體內心肌缺氧環(huán)境,檢測miR-124表達,同時過表達/抑制miR-124表達,研究miR-124在心肌細胞凋亡中的作用。其次,結合轉錄組測序和生物信息學分析,分子克隆等方法鑒定miR-124的功能性靶基因。第三,我們通過過表達靶基因探究其作用的機制。同時,采用心肌梗死小鼠模型,在缺血部位局部注射miR-124抑制劑,探討miR-124在心肌缺血模型中對心肌細胞凋亡的作用。最后,分別采集冠脈未狹窄和急性心肌梗死患者血清,觀察miR-124表達情況。結果:原代心肌細胞及細胞系經過無血清饑餓,H2O2和缺氧刺激后,miR-124的表達顯著升高。在細胞功能學研究中,CCK-8和流式細胞實驗發(fā)現過表達miR-124顯著減弱細胞活力增加細胞凋亡,反之抑制miR-124改善細胞活力和降低細胞凋亡。轉錄組測序結果和生物信息學分析預測Dhcr24是miR-124的功能性靶基因。心肌細胞過表達miR-124在mRNA和蛋白水平下調Dhcr24表達,而抑制miR-124則Dhcr24表達升高。分子克隆和雙熒光素酶報告實驗證實,過表達miR-124能顯著降低Dhcr24 3'UTR調控的熒光素酶活性,而對Dhcr24 3'UTR中miR-124結合位點進行突變后發(fā)現,miR-124對Dhcr24 3'UTR調控的熒光素酶活性沒影響。miR-124和Dhcr24過表達質粒共轉染后,我們發(fā)現miR-124增加心肌細胞凋亡率,而同時過表達Dhcr24可消除miR-124的作用。此外,Dhcr24通過調節(jié)P38MAPK/ERK及JNK磷酸化保護心肌細胞。成功建立小鼠心梗模型,發(fā)現miR-124在缺血梗死部位表達顯著升高,缺血部位局部抑制miR-124表達可明顯減少凋亡細胞比率、纖維化面積及心功能紊亂。此外,在缺血梗死部位,Dhcr24表達下降,抑制miR-124可升高Dhcr24表達,體內實驗層面驗證miR-124抑制Dhcr24表達。最后,我們發(fā)現急性心肌梗死病人血清miR-124含量明顯高于冠脈未狹窄病人,并且miR-124的升高與與心肌損傷標志物(TnI和CK-MB)呈正相關,與LVEF呈負相關,臨床樣本進一步驗證了 miR-124與心肌細胞凋亡及心功能減弱相關。結論:本研究成功地揭示了 miR-124在心肌細胞凋亡中的作用,miR-124增加心肌細胞對有害刺激的敏感性。Dhcr24是miR-124的功能性靶基因,miR-124可直接結合Dhcr24 mRNA的3'UTR區(qū)域,抑制Dhcr24表達,并通過調控Dhcr24表達影響心肌細胞凋亡。miR-124與心肌損傷標志物和LVEF相關,提示miR-124可能是治療心肌細胞凋亡相關疾病的新靶點。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22

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本文編號：2638570