【摘要】：研究背景及目標(biāo):在心肌缺血過程中,多種因素介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死和梗死后心室重構(gòu)的基本病理特征。課題組既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-124參與平滑肌表型轉(zhuǎn)化及血管損傷后新生內(nèi)膜形成。然而,對(duì)miR-124在心肌細(xì)胞凋亡中的作用依舊知之甚少。本研究試圖闡述miR-124對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用,并鑒定miR-124靶基因,闡述其作用機(jī)制。研究方法:我們采用體外分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞,利用H2O2和缺氧刺激,模擬體內(nèi)心肌缺氧環(huán)境,檢測(cè)miR-124表達(dá),同時(shí)過表達(dá)/抑制miR-124表達(dá),研究miR-124在心肌細(xì)胞凋亡中的作用。其次,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析,分子克隆等方法鑒定miR-124的功能性靶基因。第三,我們通過過表達(dá)靶基因探究其作用的機(jī)制。同時(shí),采用心肌梗死小鼠模型,在缺血部位局部注射miR-124抑制劑,探討miR-124在心肌缺血模型中對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用。最后,分別采集冠脈未狹窄和急性心肌梗死患者血清,觀察miR-124表達(dá)情況。結(jié)果:原代心肌細(xì)胞及細(xì)胞系經(jīng)過無血清饑餓,H2O2和缺氧刺激后,miR-124的表達(dá)顯著升高。在細(xì)胞功能學(xué)研究中,CCK-8和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-124顯著減弱細(xì)胞活力增加細(xì)胞凋亡,反之抑制miR-124改善細(xì)胞活力和降低細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Dhcr24是miR-124的功能性靶基因。心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-124在mRNA和蛋白水平下調(diào)Dhcr24表達(dá),而抑制miR-124則Dhcr24表達(dá)升高。分子克隆和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)miR-124能顯著降低Dhcr24 3'UTR調(diào)控的熒光素酶活性,而對(duì)Dhcr24 3'UTR中miR-124結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變后發(fā)現(xiàn),miR-124對(duì)Dhcr24 3'UTR調(diào)控的熒光素酶活性沒影響。miR-124和Dhcr24過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后,我們發(fā)現(xiàn)miR-124增加心肌細(xì)胞凋亡率,而同時(shí)過表達(dá)Dhcr24可消除miR-124的作用。此外,Dhcr24通過調(diào)節(jié)P38MAPK/ERK及JNK磷酸化保護(hù)心肌細(xì)胞。成功建立小鼠心梗模型,發(fā)現(xiàn)miR-124在缺血梗死部位表達(dá)顯著升高,缺血部位局部抑制miR-124表達(dá)可明顯減少凋亡細(xì)胞比率、纖維化面積及心功能紊亂。此外,在缺血梗死部位,Dhcr24表達(dá)下降,抑制miR-124可升高Dhcr24表達(dá),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證miR-124抑制Dhcr24表達(dá)。最后,我們發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死病人血清miR-124含量明顯高于冠脈未狹窄病人,并且miR-124的升高與與心肌損傷標(biāo)志物(TnI和CK-MB)呈正相關(guān),與LVEF呈負(fù)相關(guān),臨床樣本進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-124與心肌細(xì)胞凋亡及心功能減弱相關(guān)。結(jié)論:本研究成功地揭示了 miR-124在心肌細(xì)胞凋亡中的作用,miR-124增加心肌細(xì)胞對(duì)有害刺激的敏感性。Dhcr24是miR-124的功能性靶基因,miR-124可直接結(jié)合Dhcr24 mRNA的3'UTR區(qū)域,抑制Dhcr24表達(dá),并通過調(diào)控Dhcr24表達(dá)影響心肌細(xì)胞凋亡。miR-124與心肌損傷標(biāo)志物和LVEF相關(guān),提示miR-124可能是治療心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22

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本文編號(hào)：2638570