【摘要】:背景及目的鈣化性主動脈瓣膜疾病(Calcific aortic valve disease,CAVD)是老年病人最常見的心臟瓣膜病,鈣化是其主要的特征性病理改變。瓣膜間質(zhì)細胞(Valvular interstitial cells,VICs)是心臟瓣膜中的主要構(gòu)成細胞,現(xiàn)有研究結(jié)果證實,導致瓣膜鈣化的細胞學基礎(chǔ)包括VICs凋亡導致的被動鈣鹽沉積以及VICs向成骨細胞樣細胞表型轉(zhuǎn)化的主動調(diào)控過程。有研究發(fā)現(xiàn)ApoE~(-/-)鼠等CAVD模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)信號的激活,但ERS蛋白在瓣膜鈣化中的調(diào)控作用尚不明確,其對VICs凋亡、表型轉(zhuǎn)分化、增生的作用研究報道較少。本課題研究就是基于以上研究背景,首先探索ERS蛋白在鈣化瓣膜中的表達,分析其對VICs凋亡、表型轉(zhuǎn)分化等的調(diào)控作用。方法為以上目的,本研究分為以下三部分:(一)ERS蛋白在體外細胞鈣化模型中的表達研究:采用Ⅱ型膠原酶的方法分離培養(yǎng)來源于豬的主動脈VICs。用含10~(-7) mol/L胰島素、50μg/ml抗壞血酸、2 mmol/L磷酸二氫鈉的10%FBS DMEM鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)VICs,誘導鈣化。采用茜素紅染色檢測細胞模型內(nèi)鈣鹽沉積。采用Western blot檢測ERS蛋白在細胞模型中的表達。(二)活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)在鈣化性主動脈瓣膜組織中的表達研究:收集我科因CAVD行主動脈瓣膜置換術(shù)患者的鈣化主動脈瓣組織,心臟移植受體的正常主動脈瓣組織作為對照,采用免疫化學法檢測ATF6的表達,采用TUNEL染色檢測細胞凋亡,采用茜素紅染色檢測組織內(nèi)鈣鹽沉積。(三)ATF6對VICs生長和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控研究:VICs感染靶向抑制ATF6的腺病毒(Ad-shRNA-ATF6),采用實時定量PCR、Western blot檢測細胞中ATF6 mRNA及蛋白表達水平。構(gòu)建VICs體外細胞鈣化模型,并靶向抑制細胞模型中ATF6的表達。采用茜素紅染色檢測細胞模型內(nèi)鈣鹽沉積。采用CCK-8、流式細胞分析檢測VICs增殖和凋亡情況。采用Western blot檢測凋亡信號通路蛋白和成骨細胞表型轉(zhuǎn)化標志物表達的改變。結(jié)果(一)ERS蛋白在體外細胞鈣化模型中的表達研究:茜素紅證實在7天細胞模型中可見大量鈣鹽沉積。Western blot結(jié)果表明在鈣化誘導過程中,ATF6的表達自第1天起開始逐漸升高,第3天達到高峰,與0天未處理細胞相比,均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);第3天后ATF6的表達開始下降,第7天的表達量與0天未處理細胞相比,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與ATF6的表達趨勢一致,活化轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,Xbp1)表達也自第1天起開始逐漸升高,第3天升到高峰后開始下降,但各組細胞的表達量與0天未處理細胞相比,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。真核生物翻譯起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α,eif-2α)、生長停滯及DNA損害可誘導蛋白34(Growth arrest and DNA damage-inducible gene 34,GADD34)表達自第1天升高后降低,磷酸化真核生物翻譯起始因子2α(Phosphated eIF-2α,p-eif-2α)自第2天起開始升高,各組細胞的表達量與未處理細胞相比,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(二)ATF6在鈣化性主動脈瓣膜疾病組織中的表達研究:免疫組織化學檢測表明ATF6在CAVD瓣膜和正常瓣膜中的陽性表達分別為44.30±10.70%和9.03±7.14%,兩者相比具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。TUNEL染色表明CAVD瓣膜中的凋亡率為84.76±9.30%,相關(guān)分析表明ATF6的表達量與凋亡呈正相關(guān)(r=0.62,P0.05);茜素紅鈣化染色結(jié)果表明,瓣膜組織多為中重度鈣化,但是與ATF6表達量相關(guān)性分析并無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(三)ATF6對瓣膜間質(zhì)細胞生長和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控研究:實時定量PCR和Western blot結(jié)果均顯示感染Ad-shRNA-ATF6后VICs中ATF6表達明顯下調(diào)(P0.05)。茜素紅染色表明靶向抑制體外細胞鈣化模型中的ATF6表達后,鈣鹽沉積量顯著減少(P0.05)。流式細胞檢測表明ATF6干擾組和對照組的凋亡率分別為2.34±0.75%、8.56±1.08%,兩者相比具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。CCK-8結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時間的延長,VICs的生長活性增高;自第2天起,ATF6干擾組細胞的生長活性明顯高于對照組(P0.05)。Western blot檢測表明靶向抑制ATF6表達后,促凋亡基因Caspase-3/8、Bax表達降低,抑凋亡基因Parp表達升高,但是抑凋亡基因p-Fak表達降低。靶向抑制ATF6表達對成骨細胞表型標志物成骨轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Osterix,OSX)的表達無明顯影響。結(jié)論(一)ERS蛋白ATF6在體外細胞鈣化模型和人CAVD瓣膜組織中均高表達,且ATF6與VICs凋亡呈正相關(guān)。(二)靶向抑制ATF6的表達后,能減輕鈣化、減少VICs凋亡,并且抑制促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/8、Bax的表達,促進抑凋亡基因Parp的表達。(三)靶向抑制ATF6表達對成骨細胞表型標志物的表達無明顯影響。以上結(jié)果提示ATF6通過促進VICs凋亡推進瓣膜鈣化的進展。
【圖文】:
圖 1-1 體外 VICs 0/1/3/7 天鈣化模型茜素紅染色2、檢測 ERS 信號通路蛋白在體外 VICs 鈣化模型中的表達情況用 Western Blot 檢測 VICs 鈣化過程中 ERS 標志蛋白的表達,Image-J 分析灰如圖 1-2 所示:if-2α 表達水平分別為:(0 天)0.72±0.07、(1 天)0.81±0.05、(3 天)0.79(7 天)0.75±0.03,表達水平第 1 天即達到高峰,隨后降低;與 0 天比較,計學意義(P>0.05);-eif-2α 表達水平分別為:(0 天)0.64±0.28、(1 天)0.60±0.13、(3 天)0.63、(7 天)0.88±0.05,第 1 天表達水平降低,隨后升高;與 0 天比較,,差異意義(P>0.05);bp1 表達水平分別為:(0 天)0.79±0.11、(1 天)0.87±0.07、(3 天)0.89±0.0)0.74±0.10,表達水平自第 1 天起逐漸升高,第 3 天達到高峰,后逐漸降低比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);ADD34 表達水平分別為:(0 天)0.65±0.11、(1 天)0.69±0.14、(3 天)0

常與鈣化主動脈瓣膜中 ATF6 表達陽性率結(jié)果中 ATF6 表達與 VICs 凋亡的相關(guān)性EL 法對 CAVD 瓣膜中細胞凋亡情況進行了驗凋亡細胞核呈棕色,陽性率高,凋亡率為 84.7程中發(fā)揮一定作用。進一步分析CAVD瓣膜中 關(guān)系數(shù) r= 0.62(P < 0.0001),見圖 2-2-2,呈正能通過造成細胞凋亡使主動脈瓣膜發(fā)生鈣化。
【學位授予單位】:中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2019
【分類號】:R542.52
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本文編號:2638458
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