發(fā)布時(shí)間：2020-04-24 03:11

【摘要】：背景及目的鈣化性主動(dòng)脈瓣膜疾病(Calcific aortic valve disease,CAVD)是老年病人最常見的心臟瓣膜病,鈣化是其主要的特征性病理改變。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(Valvular interstitial cells,VICs)是心臟瓣膜中的主要構(gòu)成細(xì)胞,現(xiàn)有研究結(jié)果證實(shí),導(dǎo)致瓣膜鈣化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)包括VICs凋亡導(dǎo)致的被動(dòng)鈣鹽沉積以及VICs向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的主動(dòng)調(diào)控過程。有研究發(fā)現(xiàn)ApoE~(-/-)鼠等CAVD模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)信號(hào)的激活,但ERS蛋白在瓣膜鈣化中的調(diào)控作用尚不明確,其對(duì)VICs凋亡、表型轉(zhuǎn)分化、增生的作用研究報(bào)道較少。本課題研究就是基于以上研究背景,首先探索ERS蛋白在鈣化瓣膜中的表達(dá),分析其對(duì)VICs凋亡、表型轉(zhuǎn)分化等的調(diào)控作用。方法為以上目的,本研究分為以下三部分:(一)ERS蛋白在體外細(xì)胞鈣化模型中的表達(dá)研究:采用Ⅱ型膠原酶的方法分離培養(yǎng)來源于豬的主動(dòng)脈VICs。用含10~(-7) mol/L胰島素、50μg/ml抗壞血酸、2 mmol/L磷酸二氫鈉的10%FBS DMEM鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)VICs,誘導(dǎo)鈣化。采用茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞模型內(nèi)鈣鹽沉積。采用Western blot檢測(cè)ERS蛋白在細(xì)胞模型中的表達(dá)。(二)活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)在鈣化性主動(dòng)脈瓣膜組織中的表達(dá)研究:收集我科因CAVD行主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)患者的鈣化主動(dòng)脈瓣組織,心臟移植受體的正常主動(dòng)脈瓣組織作為對(duì)照,采用免疫化學(xué)法檢測(cè)ATF6的表達(dá),采用TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,采用茜素紅染色檢測(cè)組織內(nèi)鈣鹽沉積。(三)ATF6對(duì)VICs生長(zhǎng)和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控研究:VICs感染靶向抑制ATF6的腺病毒(Ad-shRNA-ATF6),采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ATF6 mRNA及蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建VICs體外細(xì)胞鈣化模型,并靶向抑制細(xì)胞模型中ATF6的表達(dá)。采用茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞模型內(nèi)鈣鹽沉積。采用CCK-8、流式細(xì)胞分析檢測(cè)VICs增殖和凋亡情況。采用Western blot檢測(cè)凋亡信號(hào)通路蛋白和成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)的改變。結(jié)果(一)ERS蛋白在體外細(xì)胞鈣化模型中的表達(dá)研究:茜素紅證實(shí)在7天細(xì)胞模型中可見大量鈣鹽沉積。Western blot結(jié)果表明在鈣化誘導(dǎo)過程中,ATF6的表達(dá)自第1天起開始逐漸升高,第3天達(dá)到高峰,與0天未處理細(xì)胞相比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);第3天后ATF6的表達(dá)開始下降,第7天的表達(dá)量與0天未處理細(xì)胞相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與ATF6的表達(dá)趨勢(shì)一致,活化轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,Xbp1)表達(dá)也自第1天起開始逐漸升高,第3天升到高峰后開始下降,但各組細(xì)胞的表達(dá)量與0天未處理細(xì)胞相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。真核生物翻譯起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α,eif-2α)、生長(zhǎng)停滯及DNA損害可誘導(dǎo)蛋白34(Growth arrest and DNA damage-inducible gene 34,GADD34)表達(dá)自第1天升高后降低,磷酸化真核生物翻譯起始因子2α(Phosphated eIF-2α,p-eif-2α)自第2天起開始升高,各組細(xì)胞的表達(dá)量與未處理細(xì)胞相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(二)ATF6在鈣化性主動(dòng)脈瓣膜疾病組織中的表達(dá)研究:免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明ATF6在CAVD瓣膜和正常瓣膜中的陽性表達(dá)分別為44.30±10.70%和9.03±7.14%,兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TUNEL染色表明CAVD瓣膜中的凋亡率為84.76±9.30%,相關(guān)分析表明ATF6的表達(dá)量與凋亡呈正相關(guān)(r=0.62,P0.05);茜素紅鈣化染色結(jié)果表明,瓣膜組織多為中重度鈣化,但是與ATF6表達(dá)量相關(guān)性分析并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(三)ATF6對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控研究:實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果均顯示感染Ad-shRNA-ATF6后VICs中ATF6表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。茜素紅染色表明靶向抑制體外細(xì)胞鈣化模型中的ATF6表達(dá)后,鈣鹽沉積量顯著減少(P0.05)。流式細(xì)胞檢測(cè)表明ATF6干擾組和對(duì)照組的凋亡率分別為2.34±0.75%、8.56±1.08%,兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CCK-8結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),VICs的生長(zhǎng)活性增高;自第2天起,ATF6干擾組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性明顯高于對(duì)照組(P0.05)。Western blot檢測(cè)表明靶向抑制ATF6表達(dá)后,促凋亡基因Caspase-3/8、Bax表達(dá)降低,抑凋亡基因Parp表達(dá)升高,但是抑凋亡基因p-Fak表達(dá)降低。靶向抑制ATF6表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞表型標(biāo)志物成骨轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Osterix,OSX)的表達(dá)無明顯影響。結(jié)論(一)ERS蛋白ATF6在體外細(xì)胞鈣化模型和人CAVD瓣膜組織中均高表達(dá),且ATF6與VICs凋亡呈正相關(guān)。(二)靶向抑制ATF6的表達(dá)后,能減輕鈣化、減少VICs凋亡,并且抑制促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/8、Bax的表達(dá),促進(jìn)抑凋亡基因Parp的表達(dá)。(三)靶向抑制ATF6表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果提示ATF6通過促進(jìn)VICs凋亡推進(jìn)瓣膜鈣化的進(jìn)展。
【圖文】：

圖 1-1 體外 VICs 0/1/3/7 天鈣化模型茜素紅染色2、檢測(cè) ERS 信號(hào)通路蛋白在體外 VICs 鈣化模型中的表達(dá)情況用 Western Blot 檢測(cè) VICs 鈣化過程中 ERS 標(biāo)志蛋白的表達(dá)，Image-J 分析灰如圖 1-2 所示：if-2α 表達(dá)水平分別為：（0 天）0.72±0.07、（1 天）0.81±0.05、（3 天）0.79（7 天）0.75±0.03，表達(dá)水平第 1 天即達(dá)到高峰，隨后降低；與 0 天比較，計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；-eif-2α 表達(dá)水平分別為：（0 天）0.64±0.28、（1 天）0.60±0.13、（3 天）0.63、（7 天）0.88±0.05，第 1 天表達(dá)水平降低，隨后升高；與 0 天比較，，差異意義（P＞0.05）；bp1 表達(dá)水平分別為：（0 天）0.79±0.11、（1 天）0.87±0.07、（3 天）0.89±0.0）0.74±0.10，表達(dá)水平自第 1 天起逐漸升高，第 3 天達(dá)到高峰，后逐漸降低比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ADD34 表達(dá)水平分別為：（0 天）0.65±0.11、（1 天）0.69±0.14、（3 天）0

常與鈣化主動(dòng)脈瓣膜中 ATF6 表達(dá)陽性率結(jié)果中 ATF6 表達(dá)與 VICs 凋亡的相關(guān)性EL 法對(duì) CAVD 瓣膜中細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了驗(yàn)凋亡細(xì)胞核呈棕色，陽性率高，凋亡率為 84.7程中發(fā)揮一定作用。進(jìn)一步分析CAVD瓣膜中 關(guān)系數(shù) r= 0.62（P < 0.0001），見圖 2-2-2，呈正能通過造成細(xì)胞凋亡使主動(dòng)脈瓣膜發(fā)生鈣化。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.52

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本文編號(hào)：2638458