【摘要】：研究背景與目的:動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊(vulnerable atherosclerotic plaques,VASPs)的破裂以及繼發(fā)血栓形成是引起急性心血管事件和猝死的主要因素,因此在疾病早期能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)VASPs的精確診斷和靶向治療具有重要的臨床意義。納米藥物遞送系統(tǒng)依托分子影像技術(shù)可靶向動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像,并且能夠提高抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物的治療效果。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的重要參與者,并在AS斑塊部位高表達(dá),尤其是與巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞和合成型平滑肌細(xì)胞相關(guān)的部位。因此可作為識(shí)別VASPs的分子標(biāo)志物。光動(dòng)力治療(photodynamic therapy,PDT)可在光敏劑到達(dá)病變組織后,在特定波長(zhǎng)激光照射下產(chǎn)生大量單線態(tài)氧,選擇性殺傷靶細(xì)胞�；谏鲜霰尘�,本課題構(gòu)建了具有良好生物兼容性的基于人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的納米藥物,通過(guò)耦聯(lián)OPN活性短肽和二氫卟吩e6(chlorin e6,Ce6)(螯合Mn2+行磁共振成像),同時(shí)包載光敏劑吲哚菁綠(indocyanine green,ICG),實(shí)現(xiàn)以無(wú)創(chuàng)方式通過(guò)熒光/磁共振雙模態(tài)精準(zhǔn)識(shí)別易損斑塊的同時(shí),利用ICG對(duì)VASPs部位進(jìn)行PDT,靶向殺傷VASPs內(nèi)泡沫巨噬細(xì)胞和合成型平滑肌細(xì)胞,從而抑制斑塊進(jìn)展,提高其穩(wěn)定性。研究方法:1.將RAW264.7細(xì)胞和MOVAS細(xì)胞與低密底脂蛋白共孵育24h構(gòu)建模型,分別通過(guò)免疫熒光和Western Blot驗(yàn)證模型組與對(duì)照組OPN在細(xì)胞水平的表達(dá)差異;對(duì)ApoE-/-小鼠單側(cè)頸動(dòng)脈放置縮窄環(huán)后高脂喂養(yǎng)20-24周建立頸動(dòng)脈易損斑塊模型,通過(guò)血管大體油紅染色,頸動(dòng)脈斑塊HE、馬松、天狼星紅染色及OPN、CD68、α-SMA的免疫組化來(lái)驗(yàn)證模型的建立及OPN的表達(dá)。2.將HSA分別連接OPN活性短肽和Ce6,并通過(guò)靜電作用力在PBS溶液中共包載ICG形成ICG-HSA-Ce6-OPN peptide納米藥物。用透射電鏡、馬爾文納米粒徑分析儀、紫外和熒光分光光度計(jì)對(duì)納米藥物進(jìn)行表征,驗(yàn)證其是否成功制備及具備PDT下生成活性氧的能力。3.在細(xì)胞水平將納米藥物分別與泡沫巨噬細(xì)胞和合成型平滑肌細(xì)胞模型共孵育,驗(yàn)證靶向性納米藥物是否能被模型細(xì)胞大量攝取;在動(dòng)物水平,通過(guò)尾靜脈將納米藥物注射到小鼠體內(nèi),用熒光和磁共振雙模態(tài)成像來(lái)驗(yàn)證靶向性納米藥物能否準(zhǔn)確識(shí)別VASPs。4.在細(xì)胞水平通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證納米藥物的毒性以及PDT對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDT是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;在動(dòng)物水平對(duì)小鼠連續(xù)三周PDT后行磁共振成像檢測(cè)其治療效果。研究結(jié)果:1.細(xì)胞免疫熒光和Western Blot結(jié)果均證實(shí)泡沫巨噬細(xì)胞及合成型平滑肌細(xì)胞較活化前OPN的表達(dá)量明顯增加,且活化后巨噬細(xì)胞內(nèi)OPN表達(dá)量更顯著。小鼠頸動(dòng)脈易損斑塊免疫組化結(jié)果也證實(shí)OPN與CD68和α-SMA的表達(dá)能夠共定位,且在VASPs內(nèi)可見顯著表達(dá)。證實(shí)OPN可作為分子標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)VASPs。2.電鏡結(jié)果表明制備的納米藥物粒徑均一,大小約20nm,容易滲透進(jìn)動(dòng)脈斑塊內(nèi)部被細(xì)胞攝取;馬爾文納米粒徑分析儀檢測(cè)到納米藥物體系較穩(wěn)定,不易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象;紫外吸收光譜可見各組分的特征吸收峰,證實(shí)納米藥物制備成功;熒光光譜證實(shí)納米藥物在波長(zhǎng)808nm激光照射下可迅速產(chǎn)生單線態(tài)氧,并逐漸趨于穩(wěn)定。3.泡沫巨噬細(xì)胞和合成型平滑肌細(xì)胞對(duì)OPN靶向的納米藥物均具有良好的攝取能力,證實(shí)了 OPN靶向的納米藥物對(duì)模型細(xì)胞的良好識(shí)別能力。動(dòng)物在體熒光成像觀測(cè)到靶向性納米探針能夠富集于易損斑塊模型區(qū)域,且在進(jìn)入體內(nèi)30min時(shí)信號(hào)最強(qiáng),而在對(duì)照組觀測(cè)不到明顯的熒光信號(hào)。在體磁共振成像也觀測(cè)到同樣的結(jié)果,說(shuō)明靶向性納米藥物可精準(zhǔn)識(shí)別易損斑塊。4.CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)納米藥物對(duì)細(xì)胞的毒性很小,生物相容性良好,但在PDT下對(duì)細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng);流式細(xì)胞術(shù)表明PDT是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮治療效應(yīng);動(dòng)物在體磁共振成像也證實(shí)PDT治療后,小鼠頸動(dòng)脈管腔狹窄程度得到緩解,斑塊穩(wěn)定性也有所提高。研究結(jié)論:OPN可以作為動(dòng)脈易損斑塊平滑肌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞活化的分子標(biāo)志物,靶向OPN的納米藥物通過(guò)熒光/磁共振雙模態(tài)成像,在細(xì)胞和動(dòng)物水平均能精準(zhǔn)識(shí)別動(dòng)脈易損斑塊,且納米藥物可通過(guò)光動(dòng)力治療誘導(dǎo)斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡,縮小斑塊面積,提高斑塊穩(wěn)定性。
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離子水沖洗切片。逡逑８）蘇木素染液染核５ｍｉｎ后，用１％鹽酸－乙醇溶液分化數(shù)秒，，去離子水沖洗；逡逑９）切片脫水及透明化處理方法同前。逡逑１０）晾干后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。逡逑２．７統(tǒng)計(jì)學(xué)分析逡逑用Ｅｘｃｅｌ邋２０１６繪制ＢＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Ｉｍａｇｅ邋Ｊ軟件對(duì)細(xì)胞免疫焚光和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。數(shù)據(jù)先行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性的連續(xù)型變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量以頻數(shù)或分?jǐn)?shù)表示。組間比較采用獨(dú)立樣本ｔ檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布，則采用相應(yīng)的逡逑非參數(shù)檢驗(yàn)方法。對(duì)于分類變量，采用秩和檢驗(yàn)。Ｐ＜0．0５認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑３邋結(jié)果逡逑３．１泡l赴冢希校蔚謀澩镥義希鈴危希校五危模粒校懾危停澹潁紓邋危洛義

本文編號(hào)：2632038