【摘要】：研究背景與目的:動脈粥樣硬化易損斑塊(vulnerable atherosclerotic plaques,VASPs)的破裂以及繼發(fā)血栓形成是引起急性心血管事件和猝死的主要因素,因此在疾病早期能夠同時實現(xiàn)VASPs的精確診斷和靶向治療具有重要的臨床意義。納米藥物遞送系統(tǒng)依托分子影像技術(shù)可靶向動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊實現(xiàn)多模態(tài)成像,并且能夠提高抗動脈粥樣硬化藥物的治療效果。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)被認為是動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的重要參與者,并在AS斑塊部位高表達,尤其是與巨噬細胞來源的泡沫細胞和合成型平滑肌細胞相關(guān)的部位。因此可作為識別VASPs的分子標志物。光動力治療(photodynamic therapy,PDT)可在光敏劑到達病變組織后,在特定波長激光照射下產(chǎn)生大量單線態(tài)氧,選擇性殺傷靶細胞�；谏鲜霰尘�,本課題構(gòu)建了具有良好生物兼容性的基于人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的納米藥物,通過耦聯(lián)OPN活性短肽和二氫卟吩e6(chlorin e6,Ce6)(螯合Mn2+行磁共振成像),同時包載光敏劑吲哚菁綠(indocyanine green,ICG),實現(xiàn)以無創(chuàng)方式通過熒光/磁共振雙模態(tài)精準識別易損斑塊的同時,利用ICG對VASPs部位進行PDT,靶向殺傷VASPs內(nèi)泡沫巨噬細胞和合成型平滑肌細胞,從而抑制斑塊進展,提高其穩(wěn)定性。研究方法:1.將RAW264.7細胞和MOVAS細胞與低密底脂蛋白共孵育24h構(gòu)建模型,分別通過免疫熒光和Western Blot驗證模型組與對照組OPN在細胞水平的表達差異;對ApoE-/-小鼠單側(cè)頸動脈放置縮窄環(huán)后高脂喂養(yǎng)20-24周建立頸動脈易損斑塊模型,通過血管大體油紅染色,頸動脈斑塊HE、馬松、天狼星紅染色及OPN、CD68、α-SMA的免疫組化來驗證模型的建立及OPN的表達。2.將HSA分別連接OPN活性短肽和Ce6,并通過靜電作用力在PBS溶液中共包載ICG形成ICG-HSA-Ce6-OPN peptide納米藥物。用透射電鏡、馬爾文納米粒徑分析儀、紫外和熒光分光光度計對納米藥物進行表征,驗證其是否成功制備及具備PDT下生成活性氧的能力。3.在細胞水平將納米藥物分別與泡沫巨噬細胞和合成型平滑肌細胞模型共孵育,驗證靶向性納米藥物是否能被模型細胞大量攝取;在動物水平,通過尾靜脈將納米藥物注射到小鼠體內(nèi),用熒光和磁共振雙模態(tài)成像來驗證靶向性納米藥物能否準確識別VASPs。4.在細胞水平通過CCK-8實驗驗證納米藥物的毒性以及PDT對靶細胞的殺傷作用;流式細胞術(shù)檢測PDT是否誘導(dǎo)細胞凋亡;在動物水平對小鼠連續(xù)三周PDT后行磁共振成像檢測其治療效果。研究結(jié)果:1.細胞免疫熒光和Western Blot結(jié)果均證實泡沫巨噬細胞及合成型平滑肌細胞較活化前OPN的表達量明顯增加,且活化后巨噬細胞內(nèi)OPN表達量更顯著。小鼠頸動脈易損斑塊免疫組化結(jié)果也證實OPN與CD68和α-SMA的表達能夠共定位,且在VASPs內(nèi)可見顯著表達。證實OPN可作為分子標志物來監(jiān)測VASPs。2.電鏡結(jié)果表明制備的納米藥物粒徑均一,大小約20nm,容易滲透進動脈斑塊內(nèi)部被細胞攝取;馬爾文納米粒徑分析儀檢測到納米藥物體系較穩(wěn)定,不易發(fā)生團聚現(xiàn)象;紫外吸收光譜可見各組分的特征吸收峰,證實納米藥物制備成功;熒光光譜證實納米藥物在波長808nm激光照射下可迅速產(chǎn)生單線態(tài)氧,并逐漸趨于穩(wěn)定。3.泡沫巨噬細胞和合成型平滑肌細胞對OPN靶向的納米藥物均具有良好的攝取能力,證實了 OPN靶向的納米藥物對模型細胞的良好識別能力。動物在體熒光成像觀測到靶向性納米探針能夠富集于易損斑塊模型區(qū)域,且在進入體內(nèi)30min時信號最強,而在對照組觀測不到明顯的熒光信號。在體磁共振成像也觀測到同樣的結(jié)果,說明靶向性納米藥物可精準識別易損斑塊。4.CCK-8實驗證實納米藥物對細胞的毒性很小,生物相容性良好,但在PDT下對細胞的殺傷能力顯著增強;流式細胞術(shù)表明PDT是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮治療效應(yīng);動物在體磁共振成像也證實PDT治療后,小鼠頸動脈管腔狹窄程度得到緩解,斑塊穩(wěn)定性也有所提高。研究結(jié)論:OPN可以作為動脈易損斑塊平滑肌細胞增殖和巨噬細胞活化的分子標志物,靶向OPN的納米藥物通過熒光/磁共振雙模態(tài)成像,在細胞和動物水平均能精準識別動脈易損斑塊,且納米藥物可通過光動力治療誘導(dǎo)斑塊內(nèi)細胞凋亡,縮小斑塊面積,提高斑塊穩(wěn)定性。
【圖文】：

離子水沖洗切片。逡逑８）蘇木素染液染核５ｍｉｎ后，用１％鹽酸－乙醇溶液分化數(shù)秒，，去離子水沖洗；逡逑９）切片脫水及透明化處理方法同前。逡逑１０）晾干后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。逡逑２．７統(tǒng)計學(xué)分析逡逑用Ｅｘｃｅｌ邋２０１６繪制ＢＳＡ標準曲線。用Ｉｍａｇｅ邋Ｊ軟件對細胞免疫焚光和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白條帶進行半定量分析。用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。數(shù)據(jù)先行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性的連續(xù)型變量以均數(shù)±標準差表示，分類變量以頻數(shù)或分數(shù)表示。組間比較采用獨立樣本ｔ檢驗，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布，則采用相應(yīng)的逡逑非參數(shù)檢驗方法。對于分類變量，采用秩和檢驗。Ｐ＜0．0５認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑３邋結(jié)果逡逑３．１泡l赴冢希校蔚謀澩镥義希鈴危希校五危模粒校懾危停澹潁紓邋危洛義

本文編號：2632038