【摘要】：目的:研究以9型腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV9)介導(dǎo)RNA干擾抑制大鼠心肌H9c2細(xì)胞中p65的表達(dá),通過檢測(cè)心肌肥大及纖維化相關(guān)指標(biāo),進(jìn)一步研究靶向抑制NF-κB信號(hào)通路p65對(duì)心肌細(xì)胞肥大和纖維化的影響。方法:分別將rAAV9-eGFP及rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection,MOI)轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞中,在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h-168h增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)陽(yáng)性的表達(dá)情況并確定最佳感染復(fù)數(shù)和時(shí)間,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。CCK-8法檢測(cè)病毒對(duì)H9c2細(xì)胞活力影響。將AngⅡ作為刺激因素加入到細(xì)胞中,并用qRT-PCR和Western blotting法分析p65在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。用流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡情況。ELISA檢測(cè)心房利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)、I型膠原(Col I)、III型膠原(Col III)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)在蛋白水平上的表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β在mRNA水平上的表達(dá)。結(jié)果:病毒轉(zhuǎn)染48 h后eGFP開始有表達(dá),并且表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,第120 h達(dá)最高值,此時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率為(66.96±1.12)%。與空白組相比,CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒后,H9c2細(xì)胞的活力無(wú)明顯變化。靜息狀態(tài)下H9c2細(xì)胞的NF-κB p65有一定活性,給予AngⅡ刺激后NF-κB p65的活性明顯增高,而轉(zhuǎn)染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激組的凋亡程度明顯高于空白組,而rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA組的細(xì)胞凋亡明顯受到抑制。ELISA檢測(cè)和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達(dá)情況,AngⅡ刺激組的ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達(dá)情況明顯高于空白對(duì)照組。rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA+AngⅡ組與空白對(duì)照組相比,BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達(dá)含量明顯下降,但ANP的表達(dá)含量下降不明顯。結(jié)論:利用rAAV9介導(dǎo)RNA干擾能有效轉(zhuǎn)染并抑制H9c2細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá),對(duì)H9c2細(xì)胞活性無(wú)明顯影響,并能減少血管緊張素Ⅱ作用引起的細(xì)胞凋亡,且能有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β等因子在基因和蛋白水平上的表達(dá)。
【圖文】：

新疆醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果 重組腺相關(guān)病毒體外轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定.1 H9c2 細(xì)胞的培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，剛復(fù)蘇的 H9c2 細(xì)胞呈圓形透明，懸浮于培養(yǎng)基中 24h 后換液，再次觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已貼壁，，呈短梭形，透光度好。隨著培養(yǎng)增加，貼壁細(xì)胞數(shù)量也增加,培養(yǎng)至第 3 天，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，呈長(zhǎng)梭形。培養(yǎng)至第 4 天，細(xì)胞大部分生長(zhǎng)已成融合狀態(tài)，仍呈長(zhǎng)梭形樣，此時(shí)可考（見圖 1）。

圖 2 激光共聚焦觀察不同感染復(fù)數(shù)的 eGFP 熒光轉(zhuǎn)染 H9c2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染變化Fig. 2 Laser confocal observation of transfection of eGFPfluorescently transfected Hlls with different infections(A: MOI=1×106vg/cell; B:2×106vg/ cell; C:4×106vg/ cell; D:4vg/ cell. ×200)表 1 rAAV9-eGFP 病毒轉(zhuǎn)染 H9c2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(%. x S)Table 1 Transfection efficiency of rAAV9-eGFP virus transfected H9c2 cells(%. x STime/Group 1×1062×1064×1065×10624h 0 0 0 048h 0.32±1.13 3.75±1.32 11.33±1.13 10.31±1.1872h 2.42±1.55 11.46±1.93 32.46±1.70 30.44±1.9396h 4.21±1.93 17.27±1.19 49.23±1.39 41.27±1.36120h 7.74±1.76 28.70±1.06 62.72±1.92 50.73±1.42144h 5.02±1.43 26.33±1.53 56.07±2.95 49.18±1.44168h 4.82±1.27 14.96±1.11 48.89±1.56 46.90±1.75
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 邸美仙;李應(yīng)東;劉凱;;當(dāng)歸注射液對(duì)血管緊張素Ⅱ致乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響[J];中醫(yī)藥信息;2007年02期

2 楊爽;楊凱;陸瑩;于波;;川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2010年05期

3 楊曉慧;盧新政;;心肌細(xì)胞肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];國(guó)際心血管病雜志;2008年05期

4 孫冰,付錦,張一娜;去甲腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制[J];臨床心血管病雜志;2004年04期

5 陳光輝,胡厚祥;G蛋白與心肌細(xì)胞肥大[J];嶺南心血管病雜志;2000年02期

6 雷升萍;王靚;龍子江;施慧;朱永恒;;原代心肌細(xì)胞肥大損傷模型的研究概述[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2016年03期

7 魯美麗;王洪新;張靜;楊娟;;黃芪甲苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用[J];中藥藥理與臨床;2013年05期

8 張棟;張海華;徐茂林;張權(quán)宇;裴建明;;阿片肽抑制心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制[J];臨床心血管病雜志;2011年04期

9 黃紀(jì)衛(wèi);覃數(shù);;他汀類藥物和小G蛋白及心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2007年06期

10 周小波;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與心肌細(xì)胞肥大[J];重慶醫(yī)學(xué);1998年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 呂嶸;趙培;韓志芬;章忱;郭煒;衛(wèi)洪昌;;鹽酸水蘇堿抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大效應(yīng)的作用研究[A];第十次中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五次江西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2010年

2 李愛民;李巍;耿建萌;;氯沙坦對(duì)UⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大的抑制作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)心血管病學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2013年

3 李子健;劉寧;龔開政;蔡元彬;張永新;劉志強(qiáng);韓啟德;張幼怡;;腎上腺素受體介導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)譜及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

4 潘秀頡;李玲;吳國(guó)宏;袁文俊;;尾加壓素Ⅱ促培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大作用[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第21屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2002年

5 李玲;袁文俊;;尾加壓素Ⅱ促新生大鼠心肌細(xì)胞肥大作用及其機(jī)制[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第八次全國(guó)代表大會(huì)論文摘要集（第二部分）[C];2002年

6 侯寧;羅健東;;瘦素誘導(dǎo)心肌肥大作用機(jī)制的研究—PPAR α介導(dǎo)瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[A];第九屆全國(guó)心血管藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

7 田澤君;崔煒;李擁軍;郝玉明;都軍;劉凡;祖秀光;張輝;劉素云;謝瑞琴;楊曉紅;武宇洲;;Gp130下游信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌營(yíng)養(yǎng)素-1致心肌細(xì)胞肥大中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)第八次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2004年

8 鄒永鵬;;川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、凋亡的影響[A];第十三次全國(guó)心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

9 廖月玲;章忱;趙培;單曉莉;衛(wèi)洪昌;呂嶸;;益母草水蘇堿對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大鈣攝取的影響[A];第十二次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合微循環(huán)學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議指南及論文摘要[C];2012年

10 王曉y=;劉秀華;王松;;MR-1促肌原纖維生成引起心肌細(xì)胞肥大[A];第七屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 于林君;磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN過度表達(dá)負(fù)性調(diào)控血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大及其機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

2 盛莉;阿托伐他汀上調(diào)PPARs表達(dá)及抑制心肌細(xì)胞肥大的作用[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2006年

3 馮兵;牽張刺激心肌細(xì)胞肥大的跨膜信號(hào)傳遞機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2000年

4 張弋;神經(jīng)肽Y誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的鈣調(diào)控機(jī)制研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2008年

5 侯寧;瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2010年

6 楊晉靜;溶血磷脂酸對(duì)心肌細(xì)胞肥大和抗缺氧/復(fù)氧損傷的信號(hào)調(diào)控機(jī)制[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

7 王曉y=;肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1致心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

8 張振英;CALCINEURIN-MEF2C信號(hào)途徑參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大[D];山東大學(xué);2010年

9 許旭東;miR-22在大鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

10 劉新宇;Urocortin對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響及機(jī)制[D];山東大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳德秀;激活TGR5受體對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的作用及機(jī)制[D];西南醫(yī)科大學(xué);2019年

2 邢夢(mèng)瑤;rAAV9介導(dǎo)siRNA靶向干預(yù)p65對(duì)心肌細(xì)胞肥大和纖維化相關(guān)因子的影響[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2019年

3 石方騫;CTRP9抑制高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用和機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

4 劉慧;解偶聯(lián)蛋白2通過影響Akt/Gsk-3β信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞肥大[D];南昌大學(xué);2018年

5 陸翊超;微小RNA-27b在芪藶強(qiáng)心逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2017年

6 魏瀟;松弛素和白藜蘆醇在體外高糖環(huán)境誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

7 羅漫;心肌細(xì)胞肥大過程中心臟發(fā)育相關(guān)基因的時(shí)序性表達(dá)模式研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

8 霍聰;容積敏感性氯通道對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

9 王瑾;內(nèi)源性緩繳肽對(duì)血管緊張素-I誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

10 陳軍紅;尾加壓素Ⅱ調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的作用和阿伐他汀干預(yù)效果的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2630765