【摘要】：目的:研究以9型腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV9)介導RNA干擾抑制大鼠心肌H9c2細胞中p65的表達,通過檢測心肌肥大及纖維化相關指標,進一步研究靶向抑制NF-κB信號通路p65對心肌細胞肥大和纖維化的影響。方法:分別將rAAV9-eGFP及rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按不同的感染復數(shù)(multiplicities of infection,MOI)轉染到H9c2細胞中,在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染后24h-168h增強型綠色熒光蛋白(eGFP)陽性的表達情況并確定最佳感染復數(shù)和時間,采用流式細胞術檢測其轉染效率。CCK-8法檢測病毒對H9c2細胞活力影響。將AngⅡ作為刺激因素加入到細胞中,并用qRT-PCR和Western blotting法分析p65在mRNA和蛋白水平的表達情況。用流式細胞術分析對照組及各實驗組細胞的凋亡情況。ELISA檢測心房利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)、I型膠原(Col I)、III型膠原(Col III)、轉化生長因子-β(TGF-β)在蛋白水平上的表達。qRT-PCR檢測ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β在mRNA水平上的表達。結果:病毒轉染48 h后eGFP開始有表達,并且表達強度隨著時間延長而增加,第120 h達最高值,此時流式細胞術檢測轉染率為(66.96±1.12)%。與空白組相比,CCK-8法檢測轉染病毒后,H9c2細胞的活力無明顯變化。靜息狀態(tài)下H9c2細胞的NF-κB p65有一定活性,給予AngⅡ刺激后NF-κB p65的活性明顯增高,而轉染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激組的凋亡程度明顯高于空白組,而rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA組的細胞凋亡明顯受到抑制。ELISA檢測和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),轉染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達情況,AngⅡ刺激組的ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達情況明顯高于空白對照組。rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA+AngⅡ組與空白對照組相比,BNP、Col I、Col III、TGF-β的表達含量明顯下降,但ANP的表達含量下降不明顯。結論:利用rAAV9介導RNA干擾能有效轉染并抑制H9c2細胞NF-κB p65的表達,對H9c2細胞活性無明顯影響,并能減少血管緊張素Ⅱ作用引起的細胞凋亡,且能有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β等因子在基因和蛋白水平上的表達。
【圖文】：

新疆醫(yī)科大學碩士學位論文結 果 重組腺相關病毒體外轉染效率的測定.1 H9c2 細胞的培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，剛復蘇的 H9c2 細胞呈圓形透明，懸浮于培養(yǎng)基中 24h 后換液，再次觀察時發(fā)現(xiàn)細胞已貼壁，，呈短梭形，透光度好。隨著培養(yǎng)增加，貼壁細胞數(shù)量也增加,培養(yǎng)至第 3 天，細胞處于指數(shù)生長期，呈長梭形。培養(yǎng)至第 4 天，細胞大部分生長已成融合狀態(tài)，仍呈長梭形樣，此時可考（見圖 1）。

圖 2 激光共聚焦觀察不同感染復數(shù)的 eGFP 熒光轉染 H9c2 細胞的轉染變化Fig. 2 Laser confocal observation of transfection of eGFPfluorescently transfected Hlls with different infections(A: MOI=1×106vg/cell; B:2×106vg/ cell; C:4×106vg/ cell; D:4vg/ cell. ×200)表 1 rAAV9-eGFP 病毒轉染 H9c2 細胞的轉染效率(%. x S)Table 1 Transfection efficiency of rAAV9-eGFP virus transfected H9c2 cells(%. x STime/Group 1×1062×1064×1065×10624h 0 0 0 048h 0.32±1.13 3.75±1.32 11.33±1.13 10.31±1.1872h 2.42±1.55 11.46±1.93 32.46±1.70 30.44±1.9396h 4.21±1.93 17.27±1.19 49.23±1.39 41.27±1.36120h 7.74±1.76 28.70±1.06 62.72±1.92 50.73±1.42144h 5.02±1.43 26.33±1.53 56.07±2.95 49.18±1.44168h 4.82±1.27 14.96±1.11 48.89±1.56 46.90±1.75
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 邸美仙;李應東;劉凱;;當歸注射液對血管緊張素Ⅱ致乳鼠心肌細胞肥大的影響[J];中醫(yī)藥信息;2007年02期

2 楊爽;楊凱;陸瑩;于波;;川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的影響[J];中國動脈硬化雜志;2010年05期

3 楊曉慧;盧新政;;心肌細胞肥大的信號轉導[J];國際心血管病雜志;2008年05期

4 孫冰,付錦,張一娜;去甲腎上腺素誘導心肌細胞肥大的機制[J];臨床心血管病雜志;2004年04期

5 陳光輝,胡厚祥;G蛋白與心肌細胞肥大[J];嶺南心血管病雜志;2000年02期

6 雷升萍;王靚;龍子江;施慧;朱永恒;;原代心肌細胞肥大損傷模型的研究概述[J];國際藥學研究雜志;2016年03期

7 魯美麗;王洪新;張靜;楊娟;;黃芪甲苷對脂多糖誘導心肌細胞肥大的保護作用[J];中藥藥理與臨床;2013年05期

8 張棟;張海華;徐茂林;張權宇;裴建明;;阿片肽抑制心肌細胞肥大的機制[J];臨床心血管病雜志;2011年04期

9 黃紀衛(wèi);覃數(shù);;他汀類藥物和小G蛋白及心肌細胞肥大的關系[J];心血管病學進展;2007年06期

10 周小波;堿性成纖維細胞生長因子與心肌細胞肥大[J];重慶醫(yī)學;1998年04期

相關會議論文 前10條

1 呂嶸;趙培;韓志芬;章忱;郭煒;衛(wèi)洪昌;;鹽酸水蘇堿抑制去甲腎上腺素誘導的心肌細胞肥大效應的作用研究[A];第十次中國中西醫(yī)結合學會心血管病學術大會暨第五次江西省中西醫(yī)結合學會心血管病學術大會論文匯編[C];2010年

2 李愛民;李巍;耿建萌;;氯沙坦對UⅡ誘導的乳鼠心肌細胞肥大的抑制作用[A];中華醫(yī)學會第十五次全國心血管病學大會論文匯編[C];2013年

3 李子健;劉寧;龔開政;蔡元彬;張永新;劉志強;韓啟德;張幼怡;;腎上腺素受體介導新生大鼠心肌細胞肥大相關蛋白質表達譜及其調控網絡模式[A];中國藥理學會第九次全國會員代表大會暨全國藥理學術會議論文集[C];2007年

4 潘秀頡;李玲;吳國宏;袁文俊;;尾加壓素Ⅱ促培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞肥大作用[A];中國生理學會第21屆全國代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2002年

5 李玲;袁文俊;;尾加壓素Ⅱ促新生大鼠心肌細胞肥大作用及其機制[A];中國藥理學會第八次全國代表大會論文摘要集（第二部分）[C];2002年

6 侯寧;羅健東;;瘦素誘導心肌肥大作用機制的研究—PPAR α介導瘦素誘導的心肌細胞肥大[A];第九屆全國心血管藥理學術會議論文集[C];2007年

7 田澤君;崔煒;李擁軍;郝玉明;都軍;劉凡;祖秀光;張輝;劉素云;謝瑞琴;楊曉紅;武宇洲;;Gp130下游信號傳導通路在心肌營養(yǎng)素-1致心肌細胞肥大中的作用[A];中華醫(yī)學會心血管病分會第八次全國心血管病學術會議匯編[C];2004年

8 鄒永鵬;;川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大、凋亡的影響[A];第十三次全國心血管病學術會議論文集[C];2011年

9 廖月玲;章忱;趙培;單曉莉;衛(wèi)洪昌;呂嶸;;益母草水蘇堿對去甲腎上腺素誘導乳鼠心肌細胞肥大鈣攝取的影響[A];第十二次全國中西醫(yī)結合微循環(huán)學術會議會議指南及論文摘要[C];2012年

10 王曉y=;劉秀華;王松;;MR-1促肌原纖維生成引起心肌細胞肥大[A];第七屆海峽兩岸心血管科學研討會論文集[C];2009年

相關博士學位論文 前10條

1 于林君;磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN過度表達負性調控血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大及其機制[D];第三軍醫(yī)大學;2005年

2 盛莉;阿托伐他汀上調PPARs表達及抑制心肌細胞肥大的作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

3 馮兵;牽張刺激心肌細胞肥大的跨膜信號傳遞機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2000年

4 張弋;神經肽Y誘導心肌細胞肥大的鈣調控機制研究[D];廣州醫(yī)學院;2008年

5 侯寧;瘦素誘導心肌細胞肥大的機制研究[D];廣州醫(yī)學院;2010年

6 楊晉靜;溶血磷脂酸對心肌細胞肥大和抗缺氧/復氧損傷的信號調控機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

7 王曉y=;肌纖生成調節(jié)因子-1致心肌細胞肥大的分子機制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2010年

8 張振英;CALCINEURIN-MEF2C信號途徑參與內質網應激誘導的大鼠心肌細胞肥大[D];山東大學;2010年

9 許旭東;miR-22在大鼠心肌細胞肥大中的作用[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

10 劉新宇;Urocortin對糖尿病大鼠心肌纖維化及高糖誘導心肌細胞肥大的影響及機制[D];山東大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳德秀;激活TGR5受體對內皮素-1誘導乳鼠心肌細胞肥大的作用及機制[D];西南醫(yī)科大學;2019年

2 邢夢瑤;rAAV9介導siRNA靶向干預p65對心肌細胞肥大和纖維化相關因子的影響[D];新疆醫(yī)科大學;2019年

3 石方騫;CTRP9抑制高糖誘導心肌細胞肥大的作用和機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2018年

4 劉慧;解偶聯(lián)蛋白2通過影響Akt/Gsk-3β信號通路抑制心肌細胞肥大[D];南昌大學;2018年

5 陸翊超;微小RNA-27b在芪藶強心逆轉心肌細胞肥大中的作用[D];南京醫(yī)科大學;2017年

6 魏瀟;松弛素和白藜蘆醇在體外高糖環(huán)境誘導心肌細胞肥大的作用機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

7 羅漫;心肌細胞肥大過程中心臟發(fā)育相關基因的時序性表達模式研究[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

8 霍聰;容積敏感性氯通道對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的作用[D];第四軍醫(yī)大學;2017年

9 王瑾;內源性緩繳肽對血管緊張素-I誘導乳鼠心肌細胞肥大的影響[D];山西醫(yī)科大學;2005年

10 陳軍紅;尾加壓素Ⅱ調控心肌細胞肥大的作用和阿伐他汀干預效果的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

本文編號：2630765