【摘要】：目的:評估ROS在IO引起的MDS/AML/MSCs損傷中的作用,探索HIF-1a/ROS信號通路在IO引起的MDS患者紅系凋亡中的作用及AMPK/MFF/Drp1信號通路在IO引起的MDS-MSCs凋亡中的作用。方法:(1)采用FAC在MDS/AML/MSCs中建立體外IO模型,流式確定MDS/AML/MSCs內(nèi)LIP和ROS水平。IO條件下檢測MDS/AML/MSCs凋亡、周期及增殖情況。使用DFO、NAC或Catalase處理IO的MDS/AML/MSCs,評估ROS在IO引起的MDS/AML/MSCs功能改變中的作用。(2)利用Western blotting檢測IO條件下MDS/AML細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的表達(dá)水平。構(gòu)建HIF-1a干擾和過表達(dá)慢病毒,分別轉(zhuǎn)染MDS/AML細(xì)胞,檢測HIF-1a下調(diào)或上調(diào)后MDS/AML細(xì)胞內(nèi)ROS水平。IO條件下,MDS/AML細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HIF-1a過表達(dá)慢病毒,檢測MDS/AML細(xì)胞ROS、凋亡、增殖及周期情況,確定HIF-1a在IO引起的MDS/AML細(xì)胞功能改變中的作用。分離培養(yǎng)MDS患者BMMNCs,檢測CD235a+紅系的ROS、凋亡及HIF-1a蛋白水平,確定IO條件下HIF-1a/ROS信號通路在MDS患者紅系凋亡中的作用。(3)分離培養(yǎng)MDS-MSCs,IO條件下檢測正常MSCs和MDS-MSCs內(nèi)線粒體形態(tài)、自噬水平、ATP濃度、ETC復(fù)合物I/II/III活性及MSCs凋亡、增殖情況。采用DFO、NAC或Catalase處理IO的MSCs,評估ROS在IO引起的MSCs功能改變中的作用。IO條件下,Western blotting檢測正常MSCs內(nèi)AMPK/MFF/Drp1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建AMPK CRISP/Cas9和MFF shRNA慢病毒,并轉(zhuǎn)染正常MSCs,確定AMPK/MFF/Drp1信號通路在IO引起的MSCs功能變化中的作用。采用DFO、NAC或Catalase處理IO的MDS-MSCs,Western blotting評價AMPK信號通路下游蛋白的表達(dá)情況,確定AMPK/MFF/Drp1信號通路在IO引起的MDS-MSCs損傷中的作用。結(jié)果:(1)經(jīng)檢測,FAC能增加MDS/AML/MSCs內(nèi)LIP和ROS水平,同時使MDS/AML/MSCs凋亡增加、增殖減弱及周期阻滯。采用DFO、NAC或Catalase處理IO的MDS/AML/MSCs,使MDS/AML/MSCs內(nèi)ROS水平降低,且凋亡增加、增殖減弱及周期阻滯均得到改善。說明IO可通過增加MDS/AML/MSCs內(nèi)ROS水平損傷MDS/AML/MSCs功能。(2)下調(diào)或上調(diào)MDS/AML細(xì)胞內(nèi)HIF-1a水平后,MDS/AML細(xì)胞內(nèi)ROS水平上調(diào)或下調(diào)。IO可使MDS/AML細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白表達(dá)降低,當(dāng)IO條件下上調(diào)MDS/AML細(xì)胞內(nèi)HIF-1a的水平,ROS水平降低且MDS/AML細(xì)胞凋亡增加、增殖減弱及周期阻滯均得到改善。更重要的是,HIF-1a/ROS信號通路參與IO引起的MDS患者紅系凋亡。(3)正常MSCs內(nèi),IO通過增加ROS水平和抑制ETC復(fù)合物II/III活性降低MSCs內(nèi)ATP濃度,激活了AMPK/MFF/Drp1信號通路,引起MSCs內(nèi)線粒體碎片化、自噬增加、凋亡增加和增殖減弱。MDS-MSCs內(nèi),我們也發(fā)現(xiàn)IO通過增加ROS水平,導(dǎo)致MDS-MSCs內(nèi)ATP濃度降低、凋亡增加及增殖減弱,同時線粒體碎片化和自噬增加。更重要的是,IO能夠激活MDS-MSCs內(nèi)AMPK通路。說明AMPK/MFF/Drp1信號通路在IO引起的MDS-MSCs損傷中具有重要作用。結(jié)論:IO通過增加ROS水平引起MDS/AML/MSCs凋亡增加、增殖減弱和周期阻滯;IO條件下,MDS患者紅系中HIF-1a表達(dá)降低,引起ROS表達(dá)增加,促進(jìn)MDS患者紅系凋亡;IO條件下,MDS-MSCs內(nèi)高水平ROS激活的AMPK/MFF/Drp1信號通路在MDS-MSCs線粒體損傷和細(xì)胞凋亡中具有重要作用。
【圖文】：

圖 1. MDS/AML/MSCs 細(xì)胞體外 IO 模型的建立SKM-1 細(xì)胞（A）、K562 細(xì)胞（B）和 HS-27a 細(xì)胞（C）分別采用不同濃度 FAC 處理，在不同時間點（1h、6h、12h、24h 和 48h）收集細(xì)胞，，用 CA-AM 標(biāo)記，采用流式檢測三種細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量。高鐵狀態(tài)下的 SKM-1 細(xì)胞（D）、K562 細(xì)胞（E）和 HS-27a 細(xì)胞（F）分別采用不同濃度 DFO 處理，在不同時間點（1h、6h、12h、24h 和 48h）收集細(xì)胞，用 CA-AM標(biāo)記，采用流式檢測三種細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量。Figure 1. IO models were established in MDS/AML/MSCs in vitroSKM-1 (A) / K562 (B) / HS-27a (C) cells were treated with different concentrations of FAC for 1h,6h, 12h, 24h and 48h, then cellular iron content was detected by flow cytometry with CA-AMstaining. SKM-1 (D) / K562 (E) / HS-27a (F) cells in high iron state were treated with differentconcentrations of DFO for 1h, 6h, 12h, 24h and 48h, then cellular iron content was detected byflow cytometry with CA-AM staining.2. IO 增加 MDS/AML/MSCs 細(xì)胞內(nèi) ROS 水平

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文uM）/MSCs（0uM、10 uM、100 uM、1000 uM）細(xì)胞培養(yǎng)基中作用 1h、6h、12h、24 和 48h 后細(xì)胞內(nèi) ROS 的水平。結(jié)果顯示隨著 MDS/AML/MSCs 細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的增加及作用時間的延長，MDS/AML/MSCs 細(xì)胞內(nèi) ROS 水平逐漸增加（圖2A-C）。同時結(jié)果還顯示 DFO 在降低 MDS/AML/MSCs 細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的同時也有效的降低了 ROS 水平（圖 2D-F）。上述結(jié)果表明 IO 能夠增加MDS/AML/MSCs 細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R551.3

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本文編號：2630269