【摘要】：[目的]通過體外細胞實驗驗證CSWT預(yù)處理能否抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡,并進一步探討CSWT是否通過激活PI3K/Akt、ERK1/2信號通路發(fā)揮抑制H9C2細胞凋亡的作用,同時揭示以上2個信號通路在CSWT抑制H9C2細胞凋亡的效應(yīng)中是否有協(xié)同。為將來探討CSWT預(yù)處理缺血再灌注損傷患者保護效應(yīng)的相關(guān)臨床研究提供理論依據(jù),也為今后進一步拓展CSWT治療缺血性心臟病(IHD)的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。[方法]選用來源于胚胎期大鼠心臟組織的H9C2細胞作為研究對象,分為正常對照組(control組)、缺氧/復(fù)氧組(A/R組)、CSWT+缺氧/復(fù)氧組(CSWT+A/R組)、LY294002+缺氧/復(fù)氧組(LY294002+A/R 組)、PD98059+缺氧/復(fù)氧組(PD98059+A/R 組)、LY294002+PD98059+缺氧/復(fù)氧組(LY294002+PD98059+A/R 組)、LY294002+CSWT+缺氧/復(fù)氧組(LY294002+CSWT+A/R 組)、PD98059+CSWT+缺氧/復(fù)氧組(PD98059+CSWT+A/R 組)、LY294002+PD98059+CSWT+缺氧/復(fù)氧組(LY294002+PD98059+CSWT+A/R 組),其中 LY294002、PD98059 分別為PI3K/Akt、ERK1/2信號通路抑制劑。予以CSWT預(yù)處理(每份標本均以0.09mJ/mm2能量水平給予500個脈沖波),運用模擬缺血/再灌注液培養(yǎng)法構(gòu)建H9C2細胞缺氧/復(fù)氧模型,應(yīng)用CCK8比色法、流式細胞技術(shù)分別檢測各組細胞的存活及凋亡情況,RT-PCR檢測各組細胞培養(yǎng)物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA 轉(zhuǎn)錄情況;Western-blot 檢測細胞培養(yǎng)物中 Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2的蛋白表達水平。為進一步研究CSWT預(yù)處理是否通過PI3K/Akt信號通路、ERK1/2信號通路調(diào)控缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細胞的凋亡,予LY294002、PD98059預(yù)處理細胞分別阻斷上述兩條通路,同樣的檢測各組心肌細胞的增殖及凋亡情況,各組細胞培養(yǎng)物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA轉(zhuǎn)錄情況及Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表達水平。[結(jié)果]1、CCK8法檢測各組H9C2細胞存活率情況:與Control組比,A/R組細胞存活率降低(73.40±5.23 vs 100.00±3.34,P0.05)。與 A/R組細胞存活率(73.40±5.23)相比,LY294002+A/R組(49.22±3.63)、PD98059+A/R組(60.97±4.48)細胞存活率降低(P均0.05),A/R+CSWT組(96.88±6.55)細胞存活率增加(P0.05)。與 A/R+CSWT 組(96.88±6.55)相比,Ly294002+A/R+CSWT 組(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 組(77.29±1.55)細胞存活率降低(P 均0.05)。與LY294002+A/R 組(49.22±3.63)相比,Ly294002+PD98059+A/R 組(41.06±1.42)細胞存活率降低,PD98059+A/R組(60.97±4.48)細胞存活率增加(P均0.05)。與 PD98059+A/R 組(60.97±4.48)相比,Ly294002+PD98059+A/R 組(41.06±1.42)存活率降低(P0.05)。與 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 組(55.95±4.82)相比,Ly294002+A/R+CSWT 組(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 組(77.29±1.55)細胞存活率增加(P 均0.05),Ly294002+PD98059+A/R 組(41.06±1.42)細胞存活率降低(P0.05)。PD98059+A/R+CSWT 組與 Ly294002+A/R+CSWT 組相比,細胞存活率增加(77.29±1.55vs67.01±4.71,P0.05)。2、流式細胞技術(shù)檢測各組H9C2細胞凋亡率情況:A/R組與Control組比,細胞凋亡率增加(6.29±0.21vs3.08±0.26,P0.05)。與 A/R組(6.29±0.21)相比,LY294002+A/R 組(9.54±0.25)、PD98059+A/R 組(7.95±0.39)細胞凋亡率增加(P 均0.05),A/R+CSWT 組(3.83±0.46)凋亡率減少(P0.05)。與 A/R+CSWT組(3.83±0.46)相比,Ly294002+A/R+CSWT 組(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CSWT組(4.72±0.26)細胞凋亡率增加(P 均0.05)。與 LY294002+A/R組(9.54±0.25)相比,Ly294002+PD98059+A/R 組(11.7±1.31)細胞凋亡率增加,PD98059+A/R組(7.95±0.39)細胞凋亡率減少(P 均0.05)。與 PD98059+A/R組(7.95±0.39)相比,Ly294002+PD98059+A/R組(11.7±1..31)細胞凋亡率增加(P0.05)。與Ly294002+PD98059+A/R+CSWT(6.82±0.47)相比,Ly294002+A/R+CSWT組(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CS WT 組(4.72±0.26)細胞凋亡率減少(P 均0.05),Ly294002+PD98059+A/R 組(11.7±1.31)細胞凋亡率增加(P0.05)。PD98059+A/R+CSWT組與Ly294002+A/R+CSWT組相比,細胞凋亡率減少(4.72±0.26vs5.83±0.29,P0.05)。3、RT-PCR檢測各組H9C2細胞抗凋亡基因Bcl-2、促調(diào)亡基因Bax和Casepase-3的mRNA轉(zhuǎn)錄情況示:與Control組相比,A/R組Bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低(0.40±0.02 vs 1±0.00,P0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(3.00±0.24 vs 1±0.00,1.89±0.16 vs 1±0.00,P 均0.05)。與 A/R 組相比,LY294002+ A/R 組、PD98059+A/R 組 Bcl-2 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(0.25±0.02 vs 0.40±0.02,0.30±0.01vs0.40±0.02,P 均0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在上述組間比較結(jié)果與Bcl-2相反。A/R+CSWT組與A/R組相比,Bcl-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(0.85±0.01 vs 0.40±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(1.11±0.07 vs 3.00±0.24,1.07±0.09 vs 1.89±0.16,P均0.05)。與 A/R+CSWT 組相比,Ly294002+A/R+CSWT 組、PD98059+A/R+CSWT組 Bcl-2 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(0.53±0.08 vs 0.85±0.01,0.64±0.03 vs 0.85±0.01,P 均0.05),Bax 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(2.06±0.24 vs 1.11 ±0.07,1.47±0.15 vs 1.11±0.07,P 均0.05),且 Ly294002+A/R+CSWT 組 Caspase3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平也升高(1.74±0.16 vs 1.07±0.09,P0.05)。與 LY294002+A/R 組比,Ly294002+PD98059+A/R 組 Bcl-2 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(0.16±0.02 vs 0.25±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(7.86±0.16 vs 5.40±0.05,5.71±0.25vs4.36±0.04,P 均0.05),而 PD98059+A/R 組 Bcl-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(0.30±0.01 vs 0.25±0.02,P0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(3.84±0.17vs 5.40±0.05,3.06±0.26vs4.36±0.04,P均0.05)。與 PD98059+A/R 相比,Ly294002+PD98059+A/R 組 Bcl-2的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(0.16±0.02vs0.30±0.01,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(7.86±0.16vs3.84±0.17,5.71±0.25vs3.06±0.26,P 均0.05)。與Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,Ly294002+A/R+CSWT 組和 PD98059+A/R+CSWT 組 Bcl-2的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(0.53±0.08 vs 0.38±0.01,0.64±0.03 vs 0.38±0.01,P均0.05),而Bax和Caspase3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在上述組間比較結(jié)果與 Bcl-2 相反。Ly294002+PD98059+A/R 組與 Ly294002+PD98059 +A/R+CSWT 相比,Bcl-2 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低(0.16±0.02 vs 0.38±0.01,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(7.86±0.16 vs 2.97±0.40,5.71±0.25 vs 2.26±0.18,P 均0.05)。PD98059+A/R+CSWT 與 Ly294002+A/R+CSWT 比較Bcl-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高(0.64±0.03vs0.53±0.08,P0.05)、Bax 和 Caspase3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低(1.47±0.15vs 2.06±0.24,1.20±0.16vs 1.74±0.16,P均0.05)。4、Western-blot檢測各組細胞抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Casepase-3的表達情況示:與Control組相比,A/R組Bcl-2蛋白相對表達量明顯減少(0.56±0.04 vs 1.54±0.09,P0.05),Bax 和 Caspase3 的相對表達量增加(0.54±0.04 vs 0.08±0.01,0.16±0.04vs0.06±0.01,P0.05)。與 A/R組相比,LY294002+A/R組和 PD98059+A/R 組 Bcl-2 相對表達量降低(0.15±0.01 vs 0.56±0.04,0.36±0.06 vs 0.56±0.04,P 均0.05),Bax 相對表達量增加(0.87±0.02vs0.54±0.04,0.68±0.03 vs0.54±0.04,P均0.05),且LY294002+A/R組Caspase3 的相對表達量也增加(0.27±0.03 vs 0.16±0.04,P0.05),A/R+CSWT 組 Bcl-2 相對表達量增加(0.84±0.06 vs 0.56±0.04,P0.05),而 Bax 和 Caspase3 的相對表達量降低(0.11±0.01vs0.54±0.04,0.07±0.01vs0.16±0.04,P 均0.05)。與 A/R+CSWT組比,Ly294002+A/R+CSWT組Bcl-2相對表達量明顯降低(0.68±0.06 vs 0.84±0.06,P0.05)、Bax 及 Caspase3 相對表達量增加(0.21±0.03 vs0.11±0.01,0.14±0.02 vs 0.07±0.01,P 均0.05),PD98059 +A/R+CSWT 組 Bax 相對表達量明顯增加(0.16±0.01 vs 0.11±0.01,P0.05)。與 LY294002+A/R 組比,Ly294002+PD98059+A/R 組Bcl-2 相對表達量降低(0.06±0.01 vs 0.15±0.01,P0.05)、同時 Bax 和 Caspase3 的相對表達量升高(1.11±0.02 vs 0.87±0.02,0.54±0.09vs0.27±0.03,P 均0.05),而 PD98059 + A/R 組 Bcl-2 相對表達量增加(0.36±0.06 vs 0.15±0.01,P0.05)、同時 Bax 和 Caspase3 的相對表達量降低(0.68±0.03 vs 0.87±0.02,0.20±0.02 vs 0.27±0.03,P 均0.05)。與PD98059+A/R 組相比,Ly294002+PD98059+A/R 組 Bcl-2 相對表達量降低(0.06±0.01 vs0.36±0.06,P0.05)、Bax和Caspase3的相對表達量加(1.11±0.02 vs 0.68±0.03,0.54±0.09 vs 0.20±0.02,P0.05)。與 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,PD98059+A/R+CSWT 組 Bcl-2 相對表達量升高(0.85±0.05 vs 0.47±0.06,P0.05)、Bax 和 Caspase3 的相對表達量降低(0.16±0.01 vs 0.37±0.01,0.08±0.01vs0.17±0.03,P 均0.05),Ly294002+A/R+CSWT 組Bcl-2 相對表達量升高(0.68±0.06vs0.47±0.06,P0.05)、Bax 的相對表達量降低(0.21±0.03 vs 0.37±0.01,P0.05),Ly294002+ PD98059+ A/R 組 Bcl-2 相對表達量降低(0.06±0.01vs 0.47±0.06,P0.05)、Bax和Caspase3的相對表達量升高(1.11±0.02 vs 0.37±0.01,0.54±0.09 vs 0.17±0.03,P 均0.05)。PD98059+A/R+CSWT 與Ly294002+A/R+CSWT 比較 Bcl-2 的相對表達量升高(0.85±0.05 vs 0.68±0.06,P0.05)、Bax 和 Caspase3 的相對表達量降低(0.16±0.01 vs0.21±0.03,0.08±0.01 vs0.14±0.02,P 均0.05)。5、Western-blot檢測各組細胞P-AKT、P-ERK蛋白表達情況:與Control組相比,A/R組P-AKT及P-ERK蛋白相對表達量明顯降低(0.69±0.05 vs 0.98±1.05,0.27±0.03vs0.46±0.04,P均0.05),而 A/R+CSWT組與 A/R組相比,P-AKT及P-ERK蛋白表達明顯增加(0.97±1.12vs 0.69±0.05,0.38±0.06vs 0.27±0.03,P均0.05)。與 A/R+CSW 相比,LY294002+A/R+CSWT 組 P-AKT 蛋白的相對表達量明顯減少(0.72±0.82 vs 0.97±1.12,P0.05),PD98059 +A/R+CSWT 組 P-ERK蛋白的相對表達量明顯減少(0.25±0.01 vs0.38±0.06,P0.05)。[結(jié)論]1、缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細胞凋亡的發(fā)生,其通過抑制抗凋亡因子Bcl-2表達,促進促調(diào)亡因子Bax、Caspase-3表達來實現(xiàn)上述效應(yīng),提示缺氧/復(fù)氧可能是通過線粒體途徑介導(dǎo)了 H9C2細胞凋亡的發(fā)生。2、PI3K/Akt信號通路和ERK1/2信號通路對H9C2細胞具有保護效應(yīng),能抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡。3、CSWT預(yù)處理能激活PI3K/Akt信號通路和ERK1/2信號通路,調(diào)控其下游的凋亡相關(guān)因子的表達,抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡。4、PI3K/Akt信號通路和ERK1/2信號通路在CSWT預(yù)處理抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡的過程中存在協(xié)同作用,且以PI3K/Akt信號通路占主導(dǎo)地位。
【圖文】：

邐昆明醫(yī)科大學碩士研宄生學位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１、缺氧／復(fù)氧損傷導(dǎo)致Ｈ９Ｃ２細胞形態(tài)學發(fā)生改變逡逑如圖２示：正常培養(yǎng)的Ｈ９Ｃ２細胞，為貼壁細胞，呈梭形，細胞形態(tài)清晰完逡逑整。缺氧／復(fù)氧后的Ｈ９Ｃ２細胞邊緣模糊不清，部分細胞變圓發(fā)亮，，細胞貼壁不良，逡逑甚至有部分凋亡細胞漂浮于培養(yǎng)基中。逡逑
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻】

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9 謝俊然,郁麗娜,段世明;心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡的分子調(diào)節(jié)機制[J];國外醫(yī)學.麻醉學與復(fù)蘇分冊;2005年04期

10 姚震,焦解歌,馮建章,翁陽,尹瑞興,顧申紅;心肌缺血-再灌注損傷與細胞凋亡關(guān)系的實驗研究[J];海南醫(yī)學院學報;2000年03期

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本文編號：2628476