【摘要】：目的:探究TLR4的激活調(diào)控BMP7對主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響及其分子機(jī)制,為鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)的早期干預(yù)及治療提供理論依據(jù)。方法:非CAVD瓣膜組織(non-CAVD組)取自手術(shù)治療的主動(dòng)脈夾層患者,CAVD瓣膜組織(CAVD組)取自因鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄而進(jìn)行瓣膜置換術(shù)的患者,采用免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測non-CAVD組和CAVD組中炎癥受體TLR4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)以及成骨指標(biāo)Runx2、α-SMA的蛋白表達(dá)水平。豬主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(valve interstitial cells,VICs)選取健康家豬處死立即摘取主動(dòng)脈瓣葉,分離VICs細(xì)胞,并采用免疫熒光染色行表型鑒定。采用脂多糖LPS激活VICs細(xì)胞TLR4炎癥受體后,ALP染色和茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞早期及晚期成骨分化能力;qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BMP7表達(dá)的變化,檢測細(xì)胞成骨相關(guān)基因及蛋白R(shí)unx2和OPN的表達(dá)情況。此外,豬VICs細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,感染Ad-BMP7腺病毒后,ALP染色和茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)分別檢測其對VICs細(xì)胞早期及晚期成骨分化的影響;qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測炎癥因子IL-6、IL-8及成骨相關(guān)基因及蛋白R(shí)unx2和OPN的表達(dá)情況。在LPS激活TLR4炎癥受體后,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將BMP7-siRNA轉(zhuǎn)染VICs細(xì)胞,ALP染色和茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)分別檢測其對VICs細(xì)胞早期及晚期成骨分化的影響;Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞TLR4炎癥受體、成骨相關(guān)指標(biāo)Runx2、OPN的表達(dá)情況,檢測非經(jīng)典成骨信號(hào)通路AKT、ERK1/2和經(jīng)典成骨信號(hào)通路Smad1/5/8的磷酸化水平,初步探討其機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,采用ApoE~(-/-)小鼠給予高脂飲食來構(gòu)建CAVD鈣化小鼠模型,超聲心動(dòng)圖和HE染色驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功,免疫組化法檢測小鼠模型心臟瓣膜組織中TLR4、BMP7以及成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)情況。結(jié)果:在人瓣膜組織中TLR4、BMP7以及相關(guān)成骨標(biāo)志物Runx2、α-SMA在CAVD組中表達(dá)明顯高于non-CAVD組。成功分離出原代豬VICs細(xì)胞,免疫熒光染色顯示α-SMA(+)、vimentin(+),vWF(-),細(xì)胞鑒定為豬主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。采用脂多糖LPS激活VICs細(xì)胞的TLR4炎癥受體后,可上調(diào)BMP7表達(dá),促進(jìn)其早期及晚期成骨分化能力,上調(diào)Runx2、OPN的基因及蛋白表達(dá);同時(shí),磷酸化的Akt、ERK以及BMP-Smad1/5/8蛋白表達(dá)水平均明顯增加。豬VICs細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,感染Ad-BMP7腺病毒后,促進(jìn)VICs細(xì)胞早期及晚期成骨分化能力,促進(jìn)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及Runx2、OPN的表達(dá)。在LPS激活TLR4炎癥受體后,干擾BMP7抑制了細(xì)胞早期及晚期成骨分化能力,抑制成骨相關(guān)蛋白R(shí)unx2、OPN的表達(dá),但干擾BMP7對TLR4炎癥受體表達(dá)沒有影響;僅磷酸化的Smad1/5/8蛋白水平明顯降低,對磷酸化的AKT、ERK1/2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響。CAVD鈣化小鼠模型構(gòu)建成功,鈣化小鼠模型心臟瓣膜組織中高表達(dá)TLR4,BMP7以及成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2。結(jié)論:TLR4的激活可上調(diào)BMP7促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨分化,BMP7/Smads信號(hào)通路可能在該過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

25圖 1 TLR4、BMP7 以及相關(guān)成骨指標(biāo)在鈣化瓣膜組織中表達(dá)明顯高于非鈣化瓣膜組織Fig.1 The expression of TLR4, BMP7 and Osteogenic markers in CAVD group wassignificantly higher than that in non-CAVD group.（A）The expression of TLR4, BMP7 and Runx2 in CAVD group and non-CAVD group detectedby immunohistochemistry(×200,×400); (B)The expression of TLR4, BMP7, Runx2 and α-SMAdetected by Western Blot; (C) Semiquantitative analyses of B; **P<0.01,***P<0.001.2.2 原代豬主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征及表型鑒定接種 24h 后細(xì)胞貼壁，形態(tài)呈長梭形，放射狀走行，見圖 2（A）；細(xì)胞免疫熒光染色檢測示，所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物α-SMA陽性表達(dá),見圖 2（B）；vimentin 陽性表達(dá)，見圖 2（C）；而內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物 vWF 無表達(dá)，，見圖 2（D）。結(jié)果提示，細(xì)胞鑒定為主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。

圖 2 豬主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及表型鑒定 Morphological and phenotypic characterization of porcine aortic valve interstitiLight microscopy image(×100) of VICs （;B）Immunofluorescence staining of α-SMAImmunofluorescence staining of Vimentin(×200)（;D）Immunofluorescence staining 0)TLR4 炎癥受體的激活誘導(dǎo) BMP7 的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)瓣膜間胞的成骨反應(yīng)常規(guī)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞至融合度約 50%，分別采用不同濃（0、2、4、6、8、10μg/ml）處理細(xì)胞 24h 后，qPCR 法檢測炎癥指標(biāo) T 和 IL-8 的表達(dá)情況，篩選出最適 LPS 濃度為 4μg/ml,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用見圖 3（A）；在誘導(dǎo) VICs 細(xì)胞成骨分化時(shí)，加入 LPS 處理細(xì)胞 7d 后結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS 處理組 ALP 染色明顯增加，見圖 3（
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.52

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本文編號(hào)：2628533