發(fā)布時間：2020-04-15 12:07

【摘要】：目的:探究TLR4的激活調控BMP7對主動脈瓣膜間質細胞成骨分化的影響及其分子機制,為鈣化性主動脈瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)的早期干預及治療提供理論依據(jù)。方法:非CAVD瓣膜組織(non-CAVD組)取自手術治療的主動脈夾層患者,CAVD瓣膜組織(CAVD組)取自因鈣化性主動脈瓣狹窄而進行瓣膜置換術的患者,采用免疫組化和Western blot實驗檢測non-CAVD組和CAVD組中炎癥受體TLR4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)以及成骨指標Runx2、α-SMA的蛋白表達水平。豬主動脈瓣膜間質細胞(valve interstitial cells,VICs)選取健康家豬處死立即摘取主動脈瓣葉,分離VICs細胞,并采用免疫熒光染色行表型鑒定。采用脂多糖LPS激活VICs細胞TLR4炎癥受體后,ALP染色和茜素紅S染色實驗檢測細胞早期及晚期成骨分化能力;qPCR和Western blot實驗驗證BMP7表達的變化,檢測細胞成骨相關基因及蛋白Runx2和OPN的表達情況。此外,豬VICs細胞在成骨培養(yǎng)基誘導下,感染Ad-BMP7腺病毒后,ALP染色和茜素紅S染色實驗分別檢測其對VICs細胞早期及晚期成骨分化的影響;qPCR和Western blot實驗檢測炎癥因子IL-6、IL-8及成骨相關基因及蛋白Runx2和OPN的表達情況。在LPS激活TLR4炎癥受體后,采用脂質體轉染法將BMP7-siRNA轉染VICs細胞,ALP染色和茜素紅S染色實驗分別檢測其對VICs細胞早期及晚期成骨分化的影響;Western blot實驗驗證細胞TLR4炎癥受體、成骨相關指標Runx2、OPN的表達情況,檢測非經典成骨信號通路AKT、ERK1/2和經典成骨信號通路Smad1/5/8的磷酸化水平,初步探討其機制。在體內實驗中,采用ApoE~(-/-)小鼠給予高脂飲食來構建CAVD鈣化小鼠模型,超聲心動圖和HE染色驗證模型是否構建成功,免疫組化法檢測小鼠模型心臟瓣膜組織中TLR4、BMP7以及成骨特異性轉錄因子Runx2的表達情況。結果:在人瓣膜組織中TLR4、BMP7以及相關成骨標志物Runx2、α-SMA在CAVD組中表達明顯高于non-CAVD組。成功分離出原代豬VICs細胞,免疫熒光染色顯示α-SMA(+)、vimentin(+),vWF(-),細胞鑒定為豬主動脈瓣膜間質細胞。采用脂多糖LPS激活VICs細胞的TLR4炎癥受體后,可上調BMP7表達,促進其早期及晚期成骨分化能力,上調Runx2、OPN的基因及蛋白表達;同時,磷酸化的Akt、ERK以及BMP-Smad1/5/8蛋白表達水平均明顯增加。豬VICs細胞在成骨培養(yǎng)基誘導下,感染Ad-BMP7腺病毒后,促進VICs細胞早期及晚期成骨分化能力,促進瓣膜間質細胞的炎癥反應以及Runx2、OPN的表達。在LPS激活TLR4炎癥受體后,干擾BMP7抑制了細胞早期及晚期成骨分化能力,抑制成骨相關蛋白Runx2、OPN的表達,但干擾BMP7對TLR4炎癥受體表達沒有影響;僅磷酸化的Smad1/5/8蛋白水平明顯降低,對磷酸化的AKT、ERK1/2蛋白表達水平沒有影響。CAVD鈣化小鼠模型構建成功,鈣化小鼠模型心臟瓣膜組織中高表達TLR4,BMP7以及成骨特異性轉錄因子Runx2。結論:TLR4的激活可上調BMP7促進主動脈瓣膜間質細胞成骨分化,BMP7/Smads信號通路可能在該過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

25圖 1 TLR4、BMP7 以及相關成骨指標在鈣化瓣膜組織中表達明顯高于非鈣化瓣膜組織Fig.1 The expression of TLR4, BMP7 and Osteogenic markers in CAVD group wassignificantly higher than that in non-CAVD group.（A）The expression of TLR4, BMP7 and Runx2 in CAVD group and non-CAVD group detectedby immunohistochemistry(×200,×400); (B)The expression of TLR4, BMP7, Runx2 and α-SMAdetected by Western Blot; (C) Semiquantitative analyses of B; **P<0.01,***P<0.001.2.2 原代豬主動脈瓣膜間質細胞的形態(tài)特征及表型鑒定接種 24h 后細胞貼壁，形態(tài)呈長梭形，放射狀走行，見圖 2（A）；細胞免疫熒光染色檢測示，所培養(yǎng)細胞的細胞質中，間質細胞特異性蛋白標志物α-SMA陽性表達,見圖 2（B）；vimentin 陽性表達，見圖 2（C）；而內皮細胞特異性標志物 vWF 無表達，，見圖 2（D）。結果提示，細胞鑒定為主動脈瓣膜間質細胞。

圖 2 豬主動脈瓣膜間質細胞形態(tài)及表型鑒定 Morphological and phenotypic characterization of porcine aortic valve interstitiLight microscopy image(×100) of VICs （;B）Immunofluorescence staining of α-SMAImmunofluorescence staining of Vimentin(×200)（;D）Immunofluorescence staining 0)TLR4 炎癥受體的激活誘導 BMP7 的表達上調，促進瓣膜間胞的成骨反應常規(guī)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓣膜間質細胞至融合度約 50%，分別采用不同濃（0、2、4、6、8、10μg/ml）處理細胞 24h 后，qPCR 法檢測炎癥指標 T 和 IL-8 的表達情況，篩選出最適 LPS 濃度為 4μg/ml,后續(xù)實驗均采用見圖 3（A）；在誘導 VICs 細胞成骨分化時，加入 LPS 處理細胞 7d 后結果顯示，與對照組相比，LPS 處理組 ALP 染色明顯增加，見圖 3（
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R542.52

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 廖立;蘇曉霞;金巖;;抗氧化酶系統(tǒng)異常導致衰老骨髓間充質干細胞的成骨分化能力下降[J];口腔生物醫(yī)學;2015年03期

2 劉小云;劉一舟;羅映紅;劉佳;;中藥骨碎補水煎液對間充質干細胞成骨分化的作用[J];人人健康;2017年08期

3 劉之川;簡華剛;王麗華;梅英;;體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中人臍靜脈內皮細胞對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響及機制[J];中國老年學雜志;2014年18期

4 董晨露;劉笑涵;吳琳;;骨髓間充質干細胞成骨分化的研究與進展[J];中國骨傷;2019年03期

5 付丹丹;;促骨髓基質干細胞成骨分化因子研究現(xiàn)狀[J];菏澤醫(yī)學專科學校學報;2014年02期

6 彭飛;鄭亞東;徐西強;虞冀哲;吳華;;620nm低能量紅光對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[J];激光生物學報;2011年03期

7 牛玉明;胡媛媛;冷衛(wèi)東;解龍川;賀維;陳永吉;;堿性成纖維細胞生長因子和地塞米松聯(lián)合誘導骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化[J];鄖陽醫(yī)學院學報;2010年01期

8 王博;王東;施文軍;誥建飛;劉喜全;;阿倫磷酸鈉對大鼠骨髓基質干細胞成骨分化的影響[J];中國醫(yī)療前沿;2009年22期

9 王晶;張洹;;-80℃一步法凍存對成人骨髓間充質干細胞成骨分化能力的影響[J];廣東醫(yī)學;2007年03期

10 耿英楠;韋敏;毛豪麗;;大分子擁擠對脂肪干細胞增殖及其成骨分化能力的影響[J];組織工程與重建外科雜志;2018年06期

相關會議論文 前10條

1 曹鳳儀;龍月;卓仁禧;張先正;;熒光納米探針用于干細胞早期成骨分化檢測[A];2015年全國高分子學術論文報告會論文摘要集——主題F-生物醫(yī)用高分子[C];2015年

2 李勝丹;劉一涵;;增齡對頜骨骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化能力的影響[A];2019年中華口腔醫(yī)學會口腔頜面修復專業(yè)委員會第四次全國口腔頜面修復學學術年會論文匯編[C];2019年

3 鄭亮;鄭雅元;崔燎;劉鈺瑜;;四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的作用及機制研究[A];中華醫(yī)學會第七次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議論文匯編[C];2013年

4 吳江;陳槐卿;李良;尹光福;K-L P．SUNG;;鈦顆粒負荷影響骨髓間充質干細胞成骨分化能力的機理[A];中國復合材料學術研討會論文集[C];2005年

5 吳江;陳槐卿;K-LP.SUNG;;鈦顆粒負荷影響骨髓間充質干細胞成骨分化能力的機理[A];全國首屆青年復合材料學術交流會論文集[C];2007年

6 林佳琳;張平;沈想;徐榮耀;朱偉文;傅瑜;江宏兵;;糖尿病骨髓間充質干細胞自噬,衰老及成骨分化特征[A];2018全國口腔生物醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2018年

7 董溪溪;王曉亞;邢敏;趙燦燦;郭斌;曹均凱;常江;;硅酸鹽陶瓷減弱高糖環(huán)境下誘導的骨髓間充質干細胞成骨分化抑制[A];2019年中華口腔醫(yī)學會口腔頜面修復專業(yè)委員會第四次全國口腔頜面修復學學術年會論文匯編[C];2019年

8 徐謙;崔亞洲;欒靜;周小艷;時良;崔笑笑;劉靜;韓金祥;;成肌細胞外泌體促成骨分化的作用及機制研究[A];2017第七屆泛環(huán)渤海生物化學與分子生物學會學術交流會論文集[C];2017年

9 袁風紅;鄒耀紅;高愷言;俞可佳;;地塞米松對體外人骨髓基質細胞增殖及成骨分化的影響[A];全國自身免疫性疾病專題研討會暨第十一次全國風濕病學學術年會論文匯編[C];2006年

10 陳海嘯;洪盾;萬曉晨;李繼承;;腸毒素C聯(lián)合維生素C對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響研究[A];2008年浙江省骨科學學術年會論文匯編[C];2008年

相關博士學位論文 前10條

1 劉子銘;HIF1α上調Runx2促進BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化與血管形成機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

2 刁偉藝;強直性脊柱炎胸腰椎后凸畸形截骨矯形的療效及其骨髓間充質干細胞成骨分化研究[D];南京大學;2019年

3 張順聰;長鏈非編碼RNA-ANRIL調控間充質干細胞的增殖、凋亡和成骨分化及其與骨質疏松癥的相關性研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2018年

4 許云鶴;銀納米粒子對人牙周膜成纖維細胞成骨分化作用機制研究[D];中國醫(yī)科大學;2019年

5 薛楠;miR-125b/NKIRAS2/NF-κB信號通路在人牙周膜細胞成骨分化過程中的作用及機制研究[D];中國醫(yī)科大學;2019年

6 魏思龍;雙頜逆時針大幅度前旋治療重度OSAHS研究及OSAHS調控BMSCs成骨分化初探[D];上海交通大學;2018年

7 韓亞偉;黃韌帶骨化過程中ncRNA與mRNA的交互作用網(wǎng)絡及miR-342-3p促成骨分化的作用機制[D];天津醫(yī)科大學;2019年

8 邱小玲;LINC00707通過miR-370-3p調控WNT2B影響人骨髓間充質干細胞成骨分化的研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

9 元宇;MiR-214在機械應力促進成骨分化中的作用研究[D];上海體育學院;2017年

10 萬永鮮;自噬對骨質疏松間充質干細胞成骨分化能力的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 洪浩;1肝再生增強因子（ALR）對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響 2甲狀旁腺激素對骨折愈合有效性和安全性的薈萃分析[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

2 姚歡;機械敏感離子通道TRPM7在LIPUS促進MSCs成骨分化中的作用和機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

3 程瑜;TLR4的激活調控BMP7對主動脈瓣膜間質細胞成骨分化的影響及機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

4 蔣海濤;IGF-1對地塞米松抑制間充質干細胞成骨分化的逆轉作用及機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

5 王涵;全反式維甲酸及COX-2影響B(tài)MP9誘導間充質干細胞成骨分化與Wnt/β-catenin信號的關系研究[D];重慶醫(yī)科大學;2019年

6 李林峰;氧化石墨烯氣凝膠對兔骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化的影響[D];華北理工大學;2019年

7 左婕;miR-335對牙囊細胞成骨分化能力的影響[D];新疆醫(yī)科大學;2019年

8 高歌;網(wǎng)絡藥理學方法探討川續(xù)斷皂苷Ⅵ誘導間充質干細胞成骨分化[D];吉林大學;2019年

9 李金誠;龍牙id木皂苷Ⅳ對原代破骨、成骨細胞的影響及成骨分化機制的研究[D];中央民族大學;2019年

10 夏銀蘭;QK聯(lián)合BFP-1對人牙周膜細胞增殖及成骨分化能力影響的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2628533