【摘要】：目的:短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD)是脂肪酸β氧化的關鍵酶,與心臟能量代謝密切相關。然而,SCAD在心力衰竭中的變化以及其對能量代謝的調節(jié)作用還不明確。本文通過建立不同的心力衰竭大鼠模型以及在心力衰竭病人人體水平上探討SCAD的表達變化,并觀察腺病毒介導SCAD過表達對心肌細胞凋亡和心肌梗死致心力衰竭大鼠的影響,進一步明確SCAD在心力衰竭中的作用。方法:1.建立20月齡自發(fā)性高血壓大鼠致慢性心力衰竭模型。通過超聲心動圖、血壓、左室重量指數、Masson三色染色、DHE染色、透射電鏡評價心臟病理學和超微結構的改變;線粒體JC-1法和線粒體膜腫脹檢測線粒體功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot檢測SCAD及上游信號分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達變化,檢測SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析慢性心力衰竭中心肌凋亡的情況,研究SCAD在慢性心力衰竭中的變化及其與心臟能量代謝的關系。2.采用SD大鼠冠狀動脈左前降支結扎法(Left anterior descending coronary artery ligation,LAD)建立心肌梗死致心力衰竭模型,進一步研究SCAD在心肌梗死致心力衰竭中的變化及其與心臟能量代謝的關系;同時,在運動康復訓練的干預下,研究SCAD在其中的變化趨勢,以確定SCAD在心力衰竭中是否具有積極的保護作用。通過超聲心動圖、血壓、Masson三色染色、DHE染色、透射電鏡評價心臟病理學和超微結構的改變;線粒體JC-1法和線粒體膜腫脹檢測線粒體功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot檢測SCAD及上游信號分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達變化,同時檢測SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評價心力衰竭心肌凋亡情況和能量代謝的變化。3.通過構建目的基因SCAD的腺病毒載體,尋找最佳的轉染滴度使SCAD在心肌細胞內達到最佳的表達豐度。在叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)刺激心肌細胞建立心肌細胞凋亡模型前,采用腺病毒介導的SCAD過表達進行預處理,通過RT-PCR和Western Blot檢測SCAD的表達變化,CCK-8檢測細胞增殖和活力,Hochtest33258/PI檢測細胞凋亡,觀察凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達變化,同時檢測SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評價心肌細胞的凋亡情況和能量代謝的變化。4.采用腺病毒多點注射心室壁的方法建立大鼠心肌SCAD過表達模型,Western Blot檢測SCAD在心臟中的表達變化,確定持續(xù)過表達時間。通過超聲心動圖、血壓、Masson三色染色、DHE染色、TUNEL染色評價LAD術后SCAD過表達對心臟病理學的影響;RT-PCR和Western Blot檢測SCAD、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達變化,同時檢測SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評價心肌凋亡情況和能量代謝的變化。5.選取年齡匹配的正常人和心力衰竭病人的心臟切片,采用SCAD免疫熒光法觀察SCAD的變化趨勢,探討人體水平上,SCAD是否也具有相同的變化趨勢,進一步確定SCAD作為心力衰竭藥物治療新靶點的可能性,為心力衰竭的臨床治療提供一定的啟示。結果:1.超聲心動圖結果顯示,20月齡自發(fā)性高血壓大鼠能成功復制慢性心力衰竭大鼠模型,心力衰竭大鼠的心功能各項指標明顯失衡,心力衰竭后期SHR持續(xù)的高血壓狀態(tài)出現顯著降低,可能與心力衰竭心臟的舒縮功能下降有關。慢性心力衰竭心臟出現明顯的心肌纖維化、心肌凋亡和左室病理重構,心肌細胞的超微結構受到明顯損傷,線粒體腫脹,線粒體膜電位下降,活性氧過度沉積和過度自噬加速心力衰竭的進程。同時,我們發(fā)現,SCAD的表達在慢性心力衰竭中出現了顯著下調,SCAD酶活性明顯降低,心肌和血清游離脂肪酸大量沉積,ATP含量明顯降低。2.SD大鼠心臟行冠狀動脈左前降支結扎術4周后,超聲心動圖結果顯示,大鼠LAD術后4周成功復制了心肌梗死后心力衰竭模型,后續(xù)進行持續(xù)10周的游泳運動干預。單純的LAD大鼠組,心臟病理學和心肌細胞超微結構,SCAD及其上游信號分子PPARα、凋亡因子表達變化,脂肪酸能量代謝變化與慢性心力衰竭大鼠的結果趨勢一致。有氧運動干預10周后,心力衰竭游泳組大鼠的心力衰竭進程受到明顯的抑制,同時,SCAD及其上游信號分子PPARα表達顯著提高,心臟能量代謝障礙得到明顯的改善,心功能明顯提升。3.腺病毒介導的SCAD過表達預處理下,能顯著抑制由tBHP引起的心肌細胞凋亡,同時,心肌細胞的能量代謝障礙得到明顯的改善。4.SD大鼠心臟行冠狀動脈左前降支結扎術的同時,進行左室壁多點注射腺病毒,腺病毒介導的SCAD在心臟過表達能顯著改善由于LAD術后引起的心力衰竭相關的心臟病理學變化和能量代謝障礙。5.SCAD免疫熒光結果發(fā)現,心力衰竭病人的心臟組織中,SCAD的表達變化與心力衰竭大鼠的變化趨勢一致,均呈現負性調節(jié)作用。結論:SCAD與心力衰竭密切相關,并與心力衰竭呈負性調節(jié)作用。SCAD作為心臟脂肪酸代謝供能環(huán)節(jié)的關鍵酶,提高SCAD的表達能顯著抑制心肌細胞凋亡,抑制心力衰竭進程,主要原因可能與能量代謝和線粒體凋亡通路的干預有關,SCAD具有成為心力衰竭藥物治療新靶點的可能性。
【圖文】：

圖 2-1 各組大鼠超聲心動圖比較及參數的變化Figure2-1 Representative charts of transthoracic M-mode echocardiogram and the changes ofechocardiogram parameters in rats.Compare with WKY group,aP<0.05 ,x±s, n =3．2.5.2 慢性心力衰竭大鼠的血壓變化情況（表 2-1)與 WKY 對照組相比，SHR 組大鼠的血壓明顯升高(P<0.05)；WKY 對照組4-9 月齡血壓為 110-120 mmHg，10-20 月齡血壓有所上升并維持在 130-140mmHg(P<0.05)；SHR 組 4-13 月齡血壓有所上升并維持在 200 mmHg 左右，14月齡后血壓下降并維持在 170mmHg(P<0.05)。以上結果表明，正常大鼠隨著年齡的增長，血壓有持續(xù)上升的趨勢；SHR 大鼠在 14 月齡前隨著年齡的增長，血壓持續(xù)上升，但在 14 月齡后血壓明顯下降(P<0.05)，提示自發(fā)性高血壓大鼠后期轉變?yōu)槁孕牧λソ叩倪^程血壓會有所降低，可能與心肌泵血能力障礙有關。

te：Compared with WKY control group，aP<0.01，x±s，n=6.5.4 慢性心力衰竭大鼠的心臟形態(tài)學檢查（圖 2-2）Masson 染色法結果顯示，老年 WKY 大鼠無明顯心肌纖維化；老年腔增大，，膠原沉積明顯增多，心尖部分區(qū)域室壁明顯變薄。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.6

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本文編號：2618315