【摘要】：目的:探索不同流體切應力對初級纖毛發(fā)生的影響;通過構建Dvl2(Dishevelled2)慢病毒干擾和過表達載體,探索Dvl2在此過程中的作用。方法:(1)構建可調控切應力的流體動力學體外細胞模型,將h UVECs分為靜置培養(yǎng)組(Static,STA)、紊流切應力(Disturbed Flow,DF)和層流切應力(Unidirectional Shear Stress,USS)處理組;利用免疫熒光技術檢測初級纖毛的表達定位,Real-time PCR技術和Western blot技術從分子水平檢測初級纖毛相關基因和蛋白的表達。(2)免疫熒光共定位技術觀察Dvl2與纖毛微管蛋白γ-tubulin的胞內位置關系;免疫共沉淀技術驗證Dvl2與初級纖毛相關蛋白γ-tubulin、Bbs8的胞內互作關系;Real-time PCR檢測不同F(xiàn)SS對Dvl2 m RNA相對表達量的影響。(3)構建慢病毒載體干擾Dvl2的表達量,篩選穩(wěn)轉細胞株,將細胞株分為Bc(Blank Control),Nc(Negative Control),sh-Dvl2(RNAi干擾組),OE-Dvl2(過表達Dvl2組)4個組;檢測病毒感染效率,Real-time PCR和Western blot技術檢測各組細胞的Dvl2表達量。(4)DF和USS分別作用于四組細胞;利用免疫熒光技術檢測初級纖毛的表達定位,Real-time PCR技術和Western blot技術從分子水平檢測初級纖毛相關基因和蛋白的表達。結果:(1)成功構建可調控的流體動力學體外細胞模型;免疫熒光技術可見,與STA組相比,DF作用時γ-tubulin表達定位顯著升高(P0.01),USS作用時γ-tubulin表達定位顯著降低(P0.01);Real-time PCR可見,與STA組相比,DF作用時IFT88m RNA相對表達量顯著降低(P0.01)、Bbs8 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01)、γ-tubulin m RNA相對表達量顯著升高(P0.05),而USS作用時,IFT88 m RNA相對表達量顯著升高(P0.05)、Bbs8 mRNA相對表達量顯著降低(P0.01)、γ-tubulin m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),Western blot實驗結果與Real-time PCR具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學意義。(2)免疫熒光共定位技術可見Dvl2定位于纖毛微管蛋白γ-tubulin周圍;免疫共沉淀結果可見Dvl2與Bbs8、γ-tubulin存在胞內互作關系。(3)構建慢病毒Nc(HBLV-GFP-PURO)、sh(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO sh RNA)、Dvl2(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO)成功,病毒滴度1×108TU/m L,細胞感染率98.6%;Real-time PCR檢測結果可見,與Bc組相比,Nc組Dvl2 m RNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),sh-Dvl2組Dvl2 m RNA相對表達量顯著降低(P0.01),OE-Dvl2組Dvl2 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),Western blot結果與Real-time PCR具有同樣的趨勢,且差異具有統(tǒng)計學意義,細胞株構建成功。(4)免疫熒光結果可見,DF作用時,與Bc組相比,Nc組γ-tubulin表達定位差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),sh-Dvl2組γ-tubulin表達定位顯著升高(P0.01),OE-Dvl2組γ-tubulin表達定位顯著降低(P0.05),USS作用時各組細胞γ-tubulin表達定位與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學意義;Real-time PCR檢測結果可見,DF作用時,與Bc組相比,Nc組IFT88、Bbs8、γ-tubulin m RNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),sh-Dvl2組IFT88 m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),Bbs8 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),γ-tubulin m RNA相對表達量顯著升高(P0.05),OE-Dvl2組IFT88m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),Bbs8 m RNA相對表達量顯著降低(P0.01),γ-tubulin m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),USS作用時,m RNA相對表達量與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學意義;Western blot結果可見,當DF作用時,與Bc組相比,Nc組IFT88、Bbs8、γ-tubulin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),sh-Dvl2組IFT88蛋白表達水平顯著降低(P0.01),Bbs8蛋白表達水平顯著升高(P0.05),γ-tubulin蛋白表達水平顯著升高(P0.01),USS作用時,蛋白表達水平與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學意義。結論:FSS對初級纖毛發(fā)生有影響,DF作用促進初級纖毛發(fā)生,而USS抑制初級纖毛發(fā)生;Dvl2在細胞內與纖毛基底體蛋白及微管蛋白存在互作關系;Dvl2的過表達抑制初級纖毛的發(fā)生,而沉默Dvl2后,初級纖毛發(fā)生被促進。FSS作用于內皮細胞,影響Dvl2的表達,通過Dvl2的表達影響初級纖毛的發(fā)生。
【圖文】：

5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；養(yǎng)至 80%融合度時即可進行流體切應力實驗。EK 293 T 細胞培養(yǎng)法同 hUVECs，培養(yǎng)基為含 10%FBS 的高糖 DMEM。調控切應力的流體動力學細胞模型建立用Flexcell公司Streamer系統(tǒng)建立6通道可調控切應力的流體動力學細如圖 1 所示，利用流模式控制器對 FSS 大小和方向進行調控，設置 DF式，電腦配套軟件實時監(jiān)測 FSS 情況，每次同時放入 6 張細胞爬片，SS 作用槽，兩個阻尼器排除 6 通道系統(tǒng)中的空氣，F(xiàn)SS 連續(xù)模式作用

圖 2 Co-IP 原理示意圖所需實驗試劑平衡至室溫，用超純水配制 1×交聯(lián)緩沖液；oLink 瓶子，使 AminoLin 形成均一的懸液。向并放入微量離心管中，，1000×g 離心 1 min，倒交聯(lián)緩沖液洗滌 AminoLink，離心并倒掉穿流、10 μL 20×交聯(lián)緩沖液、10 μL Dvl2 抗體添加
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2617813