【摘要】：目的:探索不同流體切應(yīng)力對初級纖毛發(fā)生的影響;通過構(gòu)建Dvl2(Dishevelled2)慢病毒干擾和過表達載體,探索Dvl2在此過程中的作用。方法:(1)構(gòu)建可調(diào)控切應(yīng)力的流體動力學(xué)體外細(xì)胞模型,將h UVECs分為靜置培養(yǎng)組(Static,STA)、紊流切應(yīng)力(Disturbed Flow,DF)和層流切應(yīng)力(Unidirectional Shear Stress,USS)處理組;利用免疫熒光技術(shù)檢測初級纖毛的表達定位,Real-time PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)從分子水平檢測初級纖毛相關(guān)基因和蛋白的表達。(2)免疫熒光共定位技術(shù)觀察Dvl2與纖毛微管蛋白γ-tubulin的胞內(nèi)位置關(guān)系;免疫共沉淀技術(shù)驗證Dvl2與初級纖毛相關(guān)蛋白γ-tubulin、Bbs8的胞內(nèi)互作關(guān)系;Real-time PCR檢測不同F(xiàn)SS對Dvl2 m RNA相對表達量的影響。(3)構(gòu)建慢病毒載體干擾Dvl2的表達量,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,將細(xì)胞株分為Bc(Blank Control),Nc(Negative Control),sh-Dvl2(RNAi干擾組),OE-Dvl2(過表達Dvl2組)4個組;檢測病毒感染效率,Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞的Dvl2表達量。(4)DF和USS分別作用于四組細(xì)胞;利用免疫熒光技術(shù)檢測初級纖毛的表達定位,Real-time PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)從分子水平檢測初級纖毛相關(guān)基因和蛋白的表達。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建可調(diào)控的流體動力學(xué)體外細(xì)胞模型;免疫熒光技術(shù)可見,與STA組相比,DF作用時γ-tubulin表達定位顯著升高(P0.01),USS作用時γ-tubulin表達定位顯著降低(P0.01);Real-time PCR可見,與STA組相比,DF作用時IFT88m RNA相對表達量顯著降低(P0.01)、Bbs8 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01)、γ-tubulin m RNA相對表達量顯著升高(P0.05),而USS作用時,IFT88 m RNA相對表達量顯著升高(P0.05)、Bbs8 mRNA相對表達量顯著降低(P0.01)、γ-tubulin m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),Western blot實驗結(jié)果與Real-time PCR具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)免疫熒光共定位技術(shù)可見Dvl2定位于纖毛微管蛋白γ-tubulin周圍;免疫共沉淀結(jié)果可見Dvl2與Bbs8、γ-tubulin存在胞內(nèi)互作關(guān)系。(3)構(gòu)建慢病毒Nc(HBLV-GFP-PURO)、sh(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO sh RNA)、Dvl2(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO)成功,病毒滴度1×108TU/m L,細(xì)胞感染率98.6%;Real-time PCR檢測結(jié)果可見,與Bc組相比,Nc組Dvl2 m RNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),sh-Dvl2組Dvl2 m RNA相對表達量顯著降低(P0.01),OE-Dvl2組Dvl2 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),Western blot結(jié)果與Real-time PCR具有同樣的趨勢,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,細(xì)胞株構(gòu)建成功。(4)免疫熒光結(jié)果可見,DF作用時,與Bc組相比,Nc組γ-tubulin表達定位差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),sh-Dvl2組γ-tubulin表達定位顯著升高(P0.01),OE-Dvl2組γ-tubulin表達定位顯著降低(P0.05),USS作用時各組細(xì)胞γ-tubulin表達定位與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;Real-time PCR檢測結(jié)果可見,DF作用時,與Bc組相比,Nc組IFT88、Bbs8、γ-tubulin m RNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),sh-Dvl2組IFT88 m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),Bbs8 m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),γ-tubulin m RNA相對表達量顯著升高(P0.05),OE-Dvl2組IFT88m RNA相對表達量顯著升高(P0.01),Bbs8 m RNA相對表達量顯著降低(P0.01),γ-tubulin m RNA相對表達量顯著降低(P0.05),USS作用時,m RNA相對表達量與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot結(jié)果可見,當(dāng)DF作用時,與Bc組相比,Nc組IFT88、Bbs8、γ-tubulin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),sh-Dvl2組IFT88蛋白表達水平顯著降低(P0.01),Bbs8蛋白表達水平顯著升高(P0.05),γ-tubulin蛋白表達水平顯著升高(P0.01),USS作用時,蛋白表達水平與DF作用具有相同趨勢,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:FSS對初級纖毛發(fā)生有影響,DF作用促進初級纖毛發(fā)生,而USS抑制初級纖毛發(fā)生;Dvl2在細(xì)胞內(nèi)與纖毛基底體蛋白及微管蛋白存在互作關(guān)系;Dvl2的過表達抑制初級纖毛的發(fā)生,而沉默Dvl2后,初級纖毛發(fā)生被促進。FSS作用于內(nèi)皮細(xì)胞,影響Dvl2的表達,通過Dvl2的表達影響初級纖毛的發(fā)生。
【圖文】：

5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；養(yǎng)至 80%融合度時即可進行流體切應(yīng)力實驗。EK 293 T 細(xì)胞培養(yǎng)法同 hUVECs，培養(yǎng)基為含 10%FBS 的高糖 DMEM。調(diào)控切應(yīng)力的流體動力學(xué)細(xì)胞模型建立用Flexcell公司Streamer系統(tǒng)建立6通道可調(diào)控切應(yīng)力的流體動力學(xué)細(xì)如圖 1 所示，利用流模式控制器對 FSS 大小和方向進行調(diào)控，設(shè)置 DF式，電腦配套軟件實時監(jiān)測 FSS 情況，每次同時放入 6 張細(xì)胞爬片，SS 作用槽，兩個阻尼器排除 6 通道系統(tǒng)中的空氣，F(xiàn)SS 連續(xù)模式作用

圖 2 Co-IP 原理示意圖所需實驗試劑平衡至室溫，用超純水配制 1×交聯(lián)緩沖液；oLink 瓶子，使 AminoLin 形成均一的懸液。向并放入微量離心管中，，1000×g 離心 1 min，倒交聯(lián)緩沖液洗滌 AminoLink，離心并倒掉穿流、10 μL 20×交聯(lián)緩沖液、10 μL Dvl2 抗體添加
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2617813