【摘要】：目的銀杏葉提取物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于東西方國(guó)家心血管疾病和血栓性疾病的預(yù)防和治療,但其生物活性成分及潛在的抗血栓機(jī)制尚未被完全闡明。凝血酶,作為調(diào)節(jié)正常凝血級(jí)聯(lián)以及血栓進(jìn)程中的關(guān)鍵絲氨酸水解酶,凝血酶抑制劑療法已被公認(rèn)為心血管和血栓性疾病預(yù)防和治療的一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。本研究旨在考查銀杏葉提取物中主要成分對(duì)人凝血酶活性的抑制能力并揭示了銀杏葉提取物對(duì)心血管疾病預(yù)防和治療的潛在機(jī)制。方法1.通過(guò)凝血酶及其熒光底物探針共同孵育的方法,利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定凝血酶熒光底物探針代謝產(chǎn)物熒光強(qiáng)度,建立體外凝血酶活性抑制測(cè)定體系。2.初步評(píng)估銀杏葉提取物中十六種主要成分對(duì)凝血酶活性抑制的能力。利用GraphPad Prism 6.0非線性擬合計(jì)算每種化合物的半數(shù)抑制濃度IC50值。3.通過(guò)設(shè)置一系列熒光底物濃度和抑制劑濃度,并利用Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖計(jì)算抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Ki)并判斷抑制類型。4.為了從酶-配體視角進(jìn)一步分析抑制劑和人凝血酶之間的相互作用力,通過(guò)分子模擬對(duì)接抑制劑和人凝血酶的活性中心,陰離子結(jié)合位點(diǎn)1和陰離子結(jié)合位點(diǎn)2,以解釋抑制原理和機(jī)制。結(jié)果1.初篩結(jié)果顯示,濃度為100μM時(shí),銀杏葉提取物中九種化合物對(duì)人凝血酶催化Z-GGRAMC水解活性的抑制率大于50%。2.進(jìn)一步評(píng)估九種化合物的半數(shù)抑制濃度IC_(50)。在所有被檢測(cè)的銀杏葉提取物成分中,四種雙黃酮類化合物包括銀杏雙黃酮,異銀杏雙黃酮,白果雙黃酮,穗花杉雙黃酮,表現(xiàn)出對(duì)凝血酶強(qiáng)烈的抑制作用,半數(shù)抑制濃度IC_(50)范圍由8.05μM到17.83μM;五種黃酮類化合物對(duì)凝血酶表現(xiàn)出中等的抑制作用,其半數(shù)抑制濃度IC_(50)范圍由23.90μM到82.08μM;萜類內(nèi)酯對(duì)凝血酶表現(xiàn)出可以忽略不計(jì)的抑制作用。3.通過(guò)設(shè)置一系列熒光探針濃度以及抑制劑濃度,進(jìn)一步研究四種雙黃酮抑制人凝血酶催化Z-GGRAMC水解的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Ki)以及抑制類型,結(jié)果證明四種雙黃酮包括銀杏雙黃酮,異銀杏雙黃酮,白果雙黃酮,穗花杉雙黃酮均為混合型抑制,抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Ki)的值分別為6.32μM、11.01μM、4.12μM、8.06μM。4.分子對(duì)接模擬發(fā)現(xiàn)四種雙黃酮分別能與人凝血酶的活性中心,陰離子結(jié)合位點(diǎn)1,陰離子結(jié)合位點(diǎn)2結(jié)合,同時(shí)細(xì)致的進(jìn)行了四種雙黃酮作為人凝血酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系學(xué)習(xí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種雙黃酮C-7或C-4’’’位置的羥基能與人凝血酶活性位點(diǎn)的氨基酸Arg-221或Lys-60通過(guò)鹽橋形成強(qiáng)烈的相互作用,這表明C-7或C-4’’’位置的羥基對(duì)人凝血酶的抑制作用是必須的。結(jié)論銀杏葉提取物中四種雙黃酮成分對(duì)凝血酶活性展現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為解釋銀杏葉提取物對(duì)心血管疾病的有益作用提供了有力的新證據(jù),也提示雙黃酮可以作為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新的雙黃酮類型的凝血酶抑制劑。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果六種化合物對(duì)人凝血酶活性的抑制能力的初步評(píng)估光產(chǎn)物 AMC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖 1。通過(guò)設(shè)置三種不同的化合物標(biāo)準(zhǔn)M, 10 μM 和 100 μM），初步研究銀杏葉提取物中 16 種主要成分對(duì)抑制作用，如圖 2 所示，在抑制劑濃度為 100 μM 時(shí)，，九種化合物異銀杏雙黃酮、白果雙黃酮、穗花杉雙黃酮、芹菜素、木犀草素奈酚、異鼠李素抑制人凝血酶催化 Z-GGRAMC acetate 水解活性大于確定其半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

圖 2 銀杏葉中 16 種主要化合物不同濃度下對(duì)人凝血酶的抑制作用2 銀杏葉中九種人凝血酶抑制劑半數(shù)抑制濃度（IC50）值進(jìn)一步計(jì)算九種化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50），通過(guò)設(shè)置一系列抑制劑濃度，擬合劑量依賴性抑制曲線，計(jì)算出九種抑制劑的半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果見(jiàn)圖 3 和表 1，其中黃芩素（一種天然的凝血酶抑制劑[23]）為陽(yáng)性對(duì)照組，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為 36.11 ± 4.68 μM。在所有檢測(cè)的銀杏葉提取物主要成分中，四個(gè)自然的雙黃酮類化合物銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、白果雙黃酮、穗花杉雙黃酮對(duì)凝血酶活性展現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 8.05 ± 1.50 μM、13.97 ± 0.92 μM、9.39 ± 0.51 μM、17.83 ± 1.11 μM；五個(gè)黃酮類化合物芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對(duì)凝血酶活性展現(xiàn)出中等的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 26.80 ± 1.74 μM、23.90 ±2.06 μM、67.73 ± 7.9 μM、31.56 ± 3.08 μM、82.08 ± 18.05 μM；而萜類內(nèi)酯對(duì)凝血酶的活性展現(xiàn)出可忽略不計(jì)的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）均大于 100
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2617600