【摘要】：目的銀杏葉提取物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于東西方國家心血管疾病和血栓性疾病的預(yù)防和治療,但其生物活性成分及潛在的抗血栓機制尚未被完全闡明。凝血酶,作為調(diào)節(jié)正常凝血級聯(lián)以及血栓進程中的關(guān)鍵絲氨酸水解酶,凝血酶抑制劑療法已被公認(rèn)為心血管和血栓性疾病預(yù)防和治療的一個有效的治療靶點。本研究旨在考查銀杏葉提取物中主要成分對人凝血酶活性的抑制能力并揭示了銀杏葉提取物對心血管疾病預(yù)防和治療的潛在機制。方法1.通過凝血酶及其熒光底物探針共同孵育的方法,利用多功能酶標(biāo)儀測定凝血酶熒光底物探針代謝產(chǎn)物熒光強度,建立體外凝血酶活性抑制測定體系。2.初步評估銀杏葉提取物中十六種主要成分對凝血酶活性抑制的能力。利用GraphPad Prism 6.0非線性擬合計算每種化合物的半數(shù)抑制濃度IC50值。3.通過設(shè)置一系列熒光底物濃度和抑制劑濃度,并利用Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖計算抑制動力學(xué)參數(shù)(Ki)并判斷抑制類型。4.為了從酶-配體視角進一步分析抑制劑和人凝血酶之間的相互作用力,通過分子模擬對接抑制劑和人凝血酶的活性中心,陰離子結(jié)合位點1和陰離子結(jié)合位點2,以解釋抑制原理和機制。結(jié)果1.初篩結(jié)果顯示,濃度為100μM時,銀杏葉提取物中九種化合物對人凝血酶催化Z-GGRAMC水解活性的抑制率大于50%。2.進一步評估九種化合物的半數(shù)抑制濃度IC_(50)。在所有被檢測的銀杏葉提取物成分中,四種雙黃酮類化合物包括銀杏雙黃酮,異銀杏雙黃酮,白果雙黃酮,穗花杉雙黃酮,表現(xiàn)出對凝血酶強烈的抑制作用,半數(shù)抑制濃度IC_(50)范圍由8.05μM到17.83μM;五種黃酮類化合物對凝血酶表現(xiàn)出中等的抑制作用,其半數(shù)抑制濃度IC_(50)范圍由23.90μM到82.08μM;萜類內(nèi)酯對凝血酶表現(xiàn)出可以忽略不計的抑制作用。3.通過設(shè)置一系列熒光探針濃度以及抑制劑濃度,進一步研究四種雙黃酮抑制人凝血酶催化Z-GGRAMC水解的抑制動力學(xué)參數(shù)(Ki)以及抑制類型,結(jié)果證明四種雙黃酮包括銀杏雙黃酮,異銀杏雙黃酮,白果雙黃酮,穗花杉雙黃酮均為混合型抑制,抑制動力學(xué)參數(shù)(Ki)的值分別為6.32μM、11.01μM、4.12μM、8.06μM。4.分子對接模擬發(fā)現(xiàn)四種雙黃酮分別能與人凝血酶的活性中心,陰離子結(jié)合位點1,陰離子結(jié)合位點2結(jié)合,同時細致的進行了四種雙黃酮作為人凝血酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系學(xué)習(xí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種雙黃酮C-7或C-4’’’位置的羥基能與人凝血酶活性位點的氨基酸Arg-221或Lys-60通過鹽橋形成強烈的相互作用,這表明C-7或C-4’’’位置的羥基對人凝血酶的抑制作用是必須的。結(jié)論銀杏葉提取物中四種雙黃酮成分對凝血酶活性展現(xiàn)出強烈的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為解釋銀杏葉提取物對心血管疾病的有益作用提供了有力的新證據(jù),也提示雙黃酮可以作為先導(dǎo)化合物設(shè)計和開發(fā)新的雙黃酮類型的凝血酶抑制劑。
【圖文】：

實驗結(jié)果六種化合物對人凝血酶活性的抑制能力的初步評估光產(chǎn)物 AMC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 1。通過設(shè)置三種不同的化合物標(biāo)準(zhǔn)M, 10 μM 和 100 μM），初步研究銀杏葉提取物中 16 種主要成分對抑制作用，如圖 2 所示，在抑制劑濃度為 100 μM 時，，九種化合物異銀杏雙黃酮、白果雙黃酮、穗花杉雙黃酮、芹菜素、木犀草素奈酚、異鼠李素抑制人凝血酶催化 Z-GGRAMC acetate 水解活性大于確定其半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

圖 2 銀杏葉中 16 種主要化合物不同濃度下對人凝血酶的抑制作用2 銀杏葉中九種人凝血酶抑制劑半數(shù)抑制濃度（IC50）值進一步計算九種化合物的半數(shù)抑制濃度（IC50），通過設(shè)置一系列抑制劑濃度，擬合劑量依賴性抑制曲線，計算出九種抑制劑的半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果見圖 3 和表 1，其中黃芩素（一種天然的凝血酶抑制劑[23]）為陽性對照組，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為 36.11 ± 4.68 μM。在所有檢測的銀杏葉提取物主要成分中，四個自然的雙黃酮類化合物銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、白果雙黃酮、穗花杉雙黃酮對凝血酶活性展現(xiàn)出強烈的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 8.05 ± 1.50 μM、13.97 ± 0.92 μM、9.39 ± 0.51 μM、17.83 ± 1.11 μM；五個黃酮類化合物芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對凝血酶活性展現(xiàn)出中等的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 26.80 ± 1.74 μM、23.90 ±2.06 μM、67.73 ± 7.9 μM、31.56 ± 3.08 μM、82.08 ± 18.05 μM；而萜類內(nèi)酯對凝血酶的活性展現(xiàn)出可忽略不計的抑制能力，其半數(shù)抑制濃度（IC50）均大于 100
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2617600